Vědci vyvíjejí novou metodu, jak zmapovat prostorový vývoj rakoviny

Vědci vyvíjejí novou metodu, jak zmapovat prostorový vývoj rakoviny

V nedávno publikované studii v Příroda Výzkumníci vyvinuli pracovní postup mapování genetických klonů, který se zaměřuje na technologii sekvenování in situ specifické pro báze (BaSISS) k odvození kvantitativních map více genetických klonů rakovinných buněk.

Lernen: Räumliche Genomik bildet die Struktur, Natur und Entwicklung von Krebsklonen ab. Bildnachweis: Lightspring/Shutterstock

pozadí

Rakovinné nebo neoplastické buňky jsou dynamické entity, které neustále mění a přetvářejí své interakce se svým mikroprostředím. Tyto buňky mají mnohočetné subklonální populace, které jsou geneticky příbuzné, ale odlišné skupiny buněk.

Ačkoli genomické technologie, jako je sekvenování celého genomu (WGS), objevily subklony, zdá se, že nejsou schopny dešifrovat jejich fenotypové vlastnosti a interakce v rámci tkáňových ekosystémů. Toto je hlavní omezení, protože všechny charakteristiky rakovinných subklonů jsou determinanty růstu rakoviny, progrese, recidivy nebo nepříznivých výsledků.

Pracovní postup BASISS

BaSISS zacílené na subklony identifikované fylogenetickým stromem odvozeným od WGS. Sondy visacího zámku specifické pro mutaci BaSISS nejprve hybridizovaly in situ s komplementární DNA (cDNA) z mutantních alel a alel divokého typu somatických variant definujících klon. Všechny plně cílené komplementární sondy visacího zámku se podvázaly a vytvořily uzavřené kruhy.

Následně fluoroforem značené dotazovací sondy a cyklická mikroskopie detekovaly jedinečné čtyř- až pětinukleotidové čárové kódy dlouhé čtečky z ligovaných sond, které byly amplifikovány amplifikací s rotujícím kruhem, což umožnilo multiplexování. Tým použil matematické modelování k vytvoření klonových map pomocí signálů BaSISS a genotypů klonů.

O studiu

V této studii výzkumníci shromáždili osm tkáňových bloků od dvou pacientů (P1 a P2), kteří podstoupili chirurgickou mastektomii pro multifokální rakovinu prsu. Tyto vzorky tkáně zahrnovaly tři histologická stádia časné progrese rakoviny: duktální karcinom in situ (DCIS), invazivní rakovinu a metastázy do lymfatických uzlin.

Na třech vzorcích P1, P1-estrogenového receptoru (ER)1, P1-ER2 a P1-D1 experimenty WGS identifikovaly mutační shluky spojené se šesti větvemi fylogenetického stromu. Sondy visacího zámku BaSISS se zaměřily na 51 alel na každé větvi fylogenetického stromu. Tým identifikoval subklon na základě identifikátoru pacienta a barvy odpovídajícího uzlu fylogenetického stromu.

Konkrétně různé barvy označené na P1 označují uzel. B. P1-fialová, P1-červená, P1-šedá, P1-oranžová, P1-zelená a P1-modrá. Podobně genotyp subklonu zahrnoval větvené mutace, které se nahromadily při přesunu z kořene stromu do uzlu subklonu. Například zelená P1 obsahovala šedé, modré a zelené větvené mutace.

Tým zkoumal tři vzorky primárního karcinomu prsu (PBC) se smíšenou invazivní a DCIS histologií: P1-ER1, P1-ER2 a P2 trojitě negativní (TN)1, aby ukázal, že BaSISS může zaznamenat vývoj různých stádií rakoviny napříč celými tkáňovými řezy. Kromě toho výzkumníci integrovali prostorová data, aby určili, jak fenotypové změny souvisí s genetickým stavem a přechody histologického stavu.

Je známo, že DCIS je geneticky heterogenní, ale jak se klony DCIS organizují a rostou v širším systému kanálků, zůstává nejasné. Tým tedy zkoumal tři vzorky DCIS z P1 (P1-D1, P1-D2 a P1-D3), které pokrývaly plochu povrchu tkáně 224 mm2. Nakonec tým provedl analýzu prostorové genové exprese pomocí cíleného sekvenování in situ (ISS).

Výsledky studie

Elektronická kniha Genetika a genomika

Kompilace top rozhovorů, článků a novinek za poslední rok. Stáhněte si bezplatnou kopii

Téměř 97 % detekovaných bodových signálů BaSISS bylo převedeno na srozumitelné čárové kódy. Jeho průměrné cílové specifické pokrytí bylo 13 000krát vyšší na 300 mm2 prsní tkáně. Variantní frakce alel odvozené z BaSISS dále vykazovaly silnou asociaci napříč replikovanými experimenty na sériových řezech tkání, což prokazuje jejich kvantitativní reprodukovatelnost. Signály BaSISS zbarvené podle jejich větve subklonální mutace ukázaly vizuální vhled do struktury subklonálního růstu.

Algoritmus klonového mapování také diskrétně upravoval pozorované frekvence alel pro řadu zkreslení (např. různá citlivost sondy BaSISS). Frekvence alel modelovaných pomocí BaSISS však byly v těsné shodě s daty z laserové záchytné mikrodisekce (LCM) a WGS validace.

V souladu s hromadnými daty WGS BaSISS detekoval dva až čtyři subklony na PBC. Kvantitativní vyšetření odhalilo, že jednotlivé subklony vytvořily prostorové vzory, které souvisely s histologickou progresí nádorových stavů. Například v P1-ER2 nebyla oblast s hyperplazií geneticky spojena s rakovinou, jak potvrdila LCM-WGS. U všech PBC byly modely genetické a histologické progrese do značné míry stabilní. Invazivní rakovina sestávala primárně z buněk z posledního divergovaného subklonu.

Naopak dřívější divergentní klony byly plně nebo částečně kolokalizovány s DCIS. Jeden subklon v každém PBC však zahrnoval jak DCIS, tak invazivní histologii. Naznačuje, že mohou existovat i samostatná histologická a genetická stádia progrese. Příklady zahrnují klon P1-red v P1-ER1 a klon P1-purple v P1-ER2.

Pokud jde o fenotypové změny spojené s invazí rakoviny, výzkumníci pozorovali, že mutantní klonální oblasti fosfatázy a homologu tenzinu (PTEN) měly hustší nukleární barvení Ki-67 imunohistochemicky (IHC) než oblasti divokého typu. Upregulace Ki-67, dalšího genetického klonu, dočasně souvisela se získáním mutace PTEN a předcházela invazi.

Oranžové epiteliální buňky P1 vykazovaly vyšší expresi regulačních onkogenů buněčného cyklu cyklinu D1 (CCND1) a cyklinu B1 (CCNB1) a onkogenu proteinu 3 zinkového prstu (ZNF703), které byly spojeny s nepříznivými klinickými výsledky. Celkově byly architektonické a jaderné vzhledy a profily genové exprese pozoruhodně liniově specifické a jejich odlišné vzory mohly být také prostorově vizualizovány.

Analýza vzorku P2-LN1 pomocí BaSISS odhalila dva klony (P2-modrý a P2-oranžový), které tvořily prostorově oddělené vzory. Histologická anotace pomocí hematoxylin&eosinu (H&E), lymfocytárního společného antigenu (CD45) a barvení pan-cytokeratinem identifikovala mnohočetné vzory metastatického růstu rakoviny. Autoři našli silné souvislosti mezi těmito dvěma objevenými klony a jejich histologickými růstovými vzory.

Dále zjistili, že vzory genové exprese specifické pro klon 17/91 genů byly rekapitulovány v mnoha, prostorově odlišných oblastech na více než 1 cm2 nádorové tkáně. Celkově klon BaSISS mapuje prostorově související genetické variace v mikroprostředích na jednotlivé klony.

Závěry

LCM, histologicky řízená odběrová technika, neposkytuje nezaujatou reprezentaci rakovinných subklonálních oblastí, zejména napříč celými nádorovými řezy. BaSISS naproti tomu zkoumal velké čtvereční centimetry tkáňové řezy, což umožnilo zkoumat celé průřezy menších nádorů. Je také relativně levná a nespoléhá se výhradně na metody založené na WGS.

Stručně řečeno, BaSISS je cenným doplňkem sady nástrojů pro prostorovou omiku díky své pozoruhodné schopnosti prostorově lokalizovat více různých rakovinných subklonů a dokonce je molekulárně charakterizovat. V budoucnu by jeho široké použití mohlo pomoci odhalit, jak rakovina roste v různých tkáních, což by zase mohlo pomoci vystopovat nešťastné subklony, které způsobují nepříznivé klinické výsledky.

Odkaz:

• Lomakin, A. et al. (2022) „Räumliche Genomik bildet die Struktur, Natur und Entwicklung von Krebsklonen ab“, Nature. doi: 10.1038/s41586-022-05425-2. https://www.nature.com/articles/s41586-022-05425-2

.