Forskere er ved at udvikle en ny metode til at kortlægge den rumlige udvikling af kræft

Forskere er ved at udvikle en ny metode til at kortlægge den rumlige udvikling af kræft

I en nyligt offentliggjort undersøgelse i Natur Forskere udviklede en genetisk klonkortlægningsworkflow, der fokuserer på base-specifik in situ sekventering (BaSISS) teknologi til at udlede kvantitative kort over flere genetiske kloner af cancerceller.

Lernen: Räumliche Genomik bildet die Struktur, Natur und Entwicklung von Krebsklonen ab. Bildnachweis: Lightspring/Shutterstock

baggrund

Kræftceller eller neoplastiske celler er dynamiske enheder, der konstant ændrer og omformer deres interaktioner med deres mikromiljø. Disse celler har flere subklonale populationer, som er genetisk beslægtede, men forskellige grupper af celler.

Selvom genomiske teknologier såsom hele genomsekventering (WGS) har opdaget subkloner, ser de ud til at være ude af stand til at dechifrere deres fænotypiske egenskaber og interaktioner inden for vævsøkosystemer. Dette er en væsentlig begrænsning, fordi alle karakteristika ved cancersubkloner er determinanter for cancervækst, progression, tilbagefald eller uønskede udfald.

BaSISS arbejdsgang

BaSISS målrettede subkloner identificeret af et WGS-afledt fylogenetisk træ. BaSISS mutationsspecifikke hængelåsprober hybridiserede først in situ med komplementært DNA (cDNA) fra mutante og vildtype alleler af klondefinerende somatiske varianter. Alle fuldt målrettede komplementære hængelåsprober ligerede og dannede lukkede cirkler.

Efterfølgende påviste fluorofor-mærkede undersøgelsesprober og cyklisk mikroskopi unikke fire- til fem-nukleotider lange læsestregkoder fra ligerede prober, der blev amplificeret ved rullende cirkelamplifikation, hvilket muliggjorde multipleksing. Holdet brugte matematisk modellering til at skabe klonkort ved hjælp af BaSISS-signaler og klonegenotyperne.

Om at studere

I denne undersøgelse indsamlede forskere otte vævsblokke fra to patienter (P1 og P2), som gennemgik kirurgisk mastektomi for multifokal brystkræft. Disse vævsprøver inkluderede tre histologiske stadier af tidlig cancerprogression: ductal carcinoma in situ (DCIS), invasiv cancer og lymfeknudemetastaser.

På tre prøver af P1, P1-østrogenreceptor (ER)1, P1-ER2 og P1-D1 identificerede WGS-eksperimenter mutationsklynger forbundet med seks fylogenetiske trægrene. BaSISS hængelåsprober målrettede 51 alleler på hver fylogenetisk trægren. Holdet identificerede en subklon baseret på en patientidentifikator og farven på den tilsvarende fylogenetiske træknude.

Specifikt angiver forskellige farver mærket på P1 en node. B. P1-lilla, P1-rød, P1-grå, P1-orange, P1-grøn og P1-blå. Ligeledes inkluderede en subklon-genotype de grenmutationer, der akkumulerede, når man flyttede fra træroden til subklonknuden. For eksempel indeholdt P1 grøn grå, blå og grønne forgreningsmutationer.

Holdet undersøgte tre prøver af primær brystkræft (PBC) med blandet invasiv og DCIS-histologi: P1-ER1, P1-ER2 og P2 triple-negative (TN)1 for at vise, at BaSISS kunne registrere udviklingen af ​​forskellige cancerstadier på tværs af hele vævssnit. Derudover integrerede forskere rumlige data for at bestemme, hvordan fænotypiske ændringer er relateret til genetisk tilstand og histologiske tilstandsovergange.

DCIS er kendt for at være genetisk heterogen, men hvordan DCIS-kloner organiserer sig og vokser gennem det bredere kanalsystem er stadig uklart. Så holdet undersøgte tre DCIS-prøver fra P1 (P1-D1, P1-D2 og P1-D3), der spændte over et vævsoverfladeareal på 224 mm2. Endelig udførte holdet rumlig genekspressionsanalyse ved hjælp af målrettet in situ-sekventering (ISS).

Studieresultater

Genetik og genomik e-bog

Samling af de bedste interviews, artikler og nyheder fra det sidste år. Download en gratis kopi

Næsten 97 % af de detekterede BaSISS-spotsignaler blev konverteret til forståelige stregkoder. Dens gennemsnitlige målspecifikke dækning var 13.000 gange højere pr. 300 mm2 brystvæv. Endvidere viste variantallelfraktionerne afledt af BaSISS stærk association på tværs af replikateksperimenter på serielle vævssnit, hvilket demonstrerede deres kvantitative reproducerbarhed. BaSISS-signalerne farvet i henhold til deres subklonale mutationsgren viste en visuel indsigt i den subklonale vækststruktur.

Klonkortlægningsalgoritmen justerede også diskret de observerede allelfrekvenser for en række skævheder (f.eks. forskellig følsomhed af BaSISS-proben). Imidlertid var de BaSISS-modellerede allelfrekvenser i tæt overensstemmelse med laser capture microdissection (LCM) og WGS-valideringsdata.

I overensstemmelse med bulk WGS-data detekterede BaSISS to til fire subkloner pr. PBC. Kvantitativ undersøgelse afslørede, at individuelle subkloner dannede rumlige mønstre, der var relateret til den histologiske progression af cancertilstande. For eksempel i P1-ER2 var en region med hyperplasi ikke genetisk relateret til cancer, som bekræftet af LCM-WGS. I alle PBC var de genetiske og histologiske progressionsmodeller stort set stabile. Den invasive cancer bestod primært af celler fra den senest divergerende subklon.

Omvendt kolokaliserede tidligere divergerende kloner helt eller delvist med DCIS. En subklon i hver PBC inkluderede imidlertid både DCIS og invasiv histologi. Det antydede, at separate histologiske og genetiske progressionsstadier også kan eksistere. Eksempler inkluderer klon P1-rød i P1-ER1 og klon P1-lilla i P1-ER2.

Med hensyn til fænotypiske ændringer forbundet med cancerinvasion, observerede forskere, at phosphatase og tensin homolog (PTEN) mutant klonale regioner havde tættere Ki-67 immunhistokemi (IHC) nuklear farvning end vildtype regioner. Opregulering af Ki-67, en anden genetisk klon, var tidsmæssigt relateret til erhvervelsen af ​​en PTEN-mutation og gik forud for invasion.

P1 orange epitelceller viste højere ekspression af de cellecyklusregulerende onkogener cyclin D1 (CCND1) og cyclin B1 (CCNB1) og onkogen zinkfingerprotein 3 (ZNF703), som var forbundet med ugunstige kliniske resultater. Samlet set var arkitektoniske og nukleare udseende og genekspressionsprofiler bemærkelsesværdigt afstamningsspecifikke, og deres forskellige mønstre kunne også visualiseres rumligt.

Analyse af prøve P2-LN1 med BaSISS opdagede to kloner (P2-blå og P2-orange), der dannede rumligt adskilte mønstre. Histologisk annotering ved hjælp af hæmatoxylin&eosin (H&E), lymfocyt-almindelig antigen (CD45) og pan-cytokeratin-farvning identificerede flere metastatiske cancervækstmønstre. Forfatterne fandt stærke sammenhænge mellem disse to opdagede kloner og deres histologiske vækstmønstre.

Ydermere fandt de, at klonspecifikke genekspressionsmønstre af 17/91 gener blev rekapituleret i flere, rumligt adskilte udstrækninger på tværs af mere end 1 cm2 tumorvæv. Generelt kortlægger BaSISS-klonen rumligt relaterede genetiske variationer i mikromiljøer til individuelle kloner.

Konklusioner

LCM, en histologistyret prøveudtagningsteknik, giver ikke en uvildig repræsentation af cancer subklonale områder, især på tværs af hele tumorsektioner. BaSISS undersøgte derimod store kvadratcentimeter vævssnit, som gjorde det muligt at undersøge hele tværsnit af mindre tumorer. Det er også relativt billigt og er ikke udelukkende afhængig af WGS-baserede metoder.

Sammenfattende er BaSISS en værdifuld tilføjelse til det rumlige omics-værktøjssæt takket være dets bemærkelsesværdige evne til rumligt at lokalisere flere forskellige cancersubkloner og endda karakterisere dem molekylært. I fremtiden kan dens udbredte brug hjælpe med at afsløre, hvordan kræft vokser i forskellige væv, hvilket igen kan hjælpe med at spore de uheldige subkloner, der forårsager uønskede kliniske resultater.

Reference:

• Lomakin, A. et al. (2022) „Räumliche Genomik bildet die Struktur, Natur und Entwicklung von Krebsklonen ab“, Nature. doi: 10.1038/s41586-022-05425-2. https://www.nature.com/articles/s41586-022-05425-2

.