Teadlased töötavad välja uut meetodit vähi ruumilise arengu kaardistamiseks

Teadlased töötavad välja uut meetodit vähi ruumilise arengu kaardistamiseks

Hiljuti avaldatud uuringus aastal Loodus Teadlased töötasid välja geneetilise kloonide kaardistamise töövoo, mis keskendub baasspetsiifilisele in situ sekveneerimise (BaSISS) tehnoloogiale, et tuletada vähirakkude mitmete geneetiliste kloonide kvantitatiivseid kaarte.

Lernen: Räumliche Genomik bildet die Struktur, Natur und Entwicklung von Krebsklonen ab. Bildnachweis: Lightspring/Shutterstock

taustal

Vähi- või neoplastilised rakud on dünaamilised üksused, mis pidevalt muudavad ja kujundavad ümber oma interaktsiooni oma mikrokeskkonnaga. Nendel rakkudel on mitu subklonaalset populatsiooni, mis on geneetiliselt seotud, kuid erinevad rakurühmad.

Kuigi genoomitehnoloogiad, nagu kogu genoomi järjestamine (WGS) on avastanud alamkloone, ei tundu nad suutvat dešifreerida nende fenotüüpseid omadusi ja koostoimeid kudede ökosüsteemides. See on peamine piirang, kuna vähi subkloonide kõik omadused on vähi kasvu, progresseerumise, kordumise või ebasoodsate tulemuste määrajad.

BaSISS-i töövoog

BaSISS-i suunatud subkloonid, mis on tuvastatud WGS-st tuletatud fülogeneetilise puu abil. BaSISS-i mutatsioonispetsiifilised tabaluku sondid hübridiseerusid esmalt in situ komplementaarse DNA-ga (cDNA), mis pärinesid klooni määratlevate somaatiliste variantide mutant- ja metsiktüüpi alleelidest. Kõik täielikult sihitud täiendavad tabaluku sondid ligeerusid ja moodustasid suletud ringid.

Seejärel tuvastasid fluorofooriga märgistatud ülekuulamissondid ja tsükliline mikroskoopia ligeeritud sondidelt ainulaadsed nelja kuni viie nukleotiidi pikkused lugeja vöötkoodid, mida amplifitseeriti veereva ringi amplifikatsiooniga, võimaldades multipleksimist. Meeskond kasutas matemaatilist modelleerimist, et luua kloonikaarte, kasutades BaSISS-i signaale ja klooni genotüüpe.

Õppimisest

Käesolevas uuringus kogusid teadlased kaheksa koeplokki kahelt patsiendilt (P1 ja P2), kellele tehti multifokaalse rinnavähi kirurgiline mastektoomia. Need koeproovid sisaldasid varajase vähi progresseerumise kolme histoloogilist staadiumi: duktaalne kartsinoom in situ (DCIS), invasiivne vähk ja lümfisõlmede metastaasid.

Kolmel P1, P1-östrogeeni retseptori (ER)1, P1-ER2 ja P1-D1 proovil tuvastasid WGS-i katsed mutatsiooniklastrid, mis olid seotud kuue fülogeneetilise puuharuga. BaSISS tabaluku sondid sihtisid 51 alleeli igal filogeneetilisel puuoksal. Töörühm tuvastas patsiendi identifikaatori ja vastava fülogeneetilise puu sõlme värvi põhjal alamklooni.

Täpsemalt tähistavad P1-l märgitud erinevad värvid sõlme. B. P1-lilla, P1-punane, P1-hall, P1-oranž, P1-roheline ja P1-sinine. Samuti hõlmas subklooni genotüüp haru mutatsioone, mis kogunesid puujuurest subklooni sõlme liikudes. Näiteks P1 roheline sisaldas halli, sinist ja rohelist hargnevat mutatsiooni.

Meeskond uuris kolme primaarse rinnavähi (PBC) proovi segatud invasiivse ja DCIS-histoloogiaga: P1-ER1, P1-ER2 ja P2 kolmiknegatiivne (TN)1, et näidata, et BaSISS suudab registreerida vähi erinevate staadiumite arengut kogu koelõikudes. Lisaks integreerisid teadlased ruumiandmed, et teha kindlaks, kuidas fenotüübilised muutused on seotud geneetilise seisundi ja histoloogilise seisundi üleminekuga.

DCIS on teadaolevalt geneetiliselt heterogeenne, kuid ebaselge on see, kuidas DCIS-i kloonid laiema kanalisüsteemi kaudu organiseeruvad ja kasvavad. Nii uuris meeskond kolme DCIS-i proovi P1-st (P1-D1, P1-D2 ja P1-D3), mille koe pindala oli 224 mm2. Lõpuks viis meeskond läbi ruumilise geeniekspressiooni analüüsi, kasutades suunatud in situ sekveneerimist (ISS).

Uuringu tulemused

Geneetika ja genoomika e-raamat

Eelmise aasta tippintervjuude, artiklite ja uudiste koostamine. Laadige alla tasuta koopia

Peaaegu 97% tuvastatud BaSISS-i punktsignaalidest teisendati arusaadavateks vöötkoodideks. Selle keskmine sihtmärgispetsiifiline katvus oli 13 000 korda suurem 300 mm2 rinnakoe kohta. Lisaks näitasid BaSISS-ist tuletatud alleelivariantide fraktsioonid tugevat seost järjestikuste koelõikude korduskatsete vahel, näidates nende kvantitatiivset reprodutseeritavust. Vastavalt nende subklonaalsele mutatsiooniharule värvitud BaSISS-signaalid näitasid visuaalset ülevaadet subklonaalsest kasvustruktuurist.

Kloonide kaardistamise algoritm kohandas diskreetselt ka vaadeldud alleelisagedusi mitmete kõrvalekallete jaoks (nt BaSISS-i sondi erinev tundlikkus). Kuid BaSISS-modelleeritud alleeli sagedused olid tihedas kooskõlas laserpüüdmise mikrodissektsiooni (LCM) ja WGS-i valideerimisandmetega.

Kooskõlas WGS-i hulgiandmetega tuvastas BaSISS kaks kuni neli subklooni PBC kohta. Kvantitatiivne uuring näitas, et üksikud subkloonid moodustasid ruumilisi mustreid, mis olid seotud vähi seisundite histoloogilise progresseerumisega. Näiteks P1-ER2 puhul ei olnud hüperplaasiaga piirkond vähiga geneetiliselt seotud, nagu kinnitas LCM-WGS. Kõigis PBC-des olid geneetilised ja histoloogilised progresseerumismudelid suures osas stabiilsed. Invasiivne vähk koosnes peamiselt rakkudest, mis pärinevad viimati lahknenud subkloonist.

Seevastu varasemad erinevad kloonid kolokaliseeriti täielikult või osaliselt DCIS-iga. Kuid iga PBC üks subkloon sisaldas nii DCIS-i kui ka invasiivset histoloogiat. See viitas sellele, et võivad eksisteerida ka eraldi histoloogilised ja geneetilised progresseerumisetapid. Näited hõlmavad klooni P1-punast P1-ER1-s ja klooni P1-lillat P1-ER2-s.

Vähi invasiooniga seotud fenotüüpiliste muutuste osas täheldasid teadlased, et fosfataasi ja tensiini homoloogi (PTEN) mutantsete klonaalsete piirkondade Ki-67 immunohistokeemia (IHC) tuuma värvus oli tihedam kui metsiktüüpi piirkondades. Teise geneetilise klooni Ki-67 ülesreguleerimine oli ajaliselt seotud PTEN-i mutatsiooni omandamisega ja eelnes invasioonile.

P1 oranžid epiteelirakud näitasid rakutsüklit reguleerivate onkogeenide tsükliin D1 (CCND1) ja tsükliin B1 (CCNB1) ning onkogeeni tsink-sõrme valgu 3 (ZNF703) kõrgemat ekspressiooni, mida seostati ebasoodsate kliiniliste tulemustega. Üldiselt olid arhitektuurilised ja tuumanäitajad ning geeniekspressiooniprofiilid märkimisväärselt liinispetsiifilised ning nende erinevaid mustreid sai ka ruumiliselt visualiseerida.

Proovi P2-LN1 analüüs BaSISS-iga avastas kaks klooni (P2-sinine ja P2-oranž), mis moodustasid ruumiliselt eraldi mustrid. Histoloogiline annotatsioon, kasutades hematoksüliini ja eosiini (H&E), lümfotsüütide ühist antigeeni (CD45) ja pan-tsütokeratiini plekke, tuvastas mitu metastaatilise vähi kasvumustrit. Autorid leidsid tugevaid seoseid nende kahe avastatud klooni ja nende histoloogiliste kasvumustrite vahel.

Lisaks leidsid nad, et 17/91 geeni kloonispetsiifilised geeniekspressioonimustrid võeti kokku mitmes, ruumiliselt erinevas ulatuses rohkem kui 1 cm2 kasvajakoes. Üldiselt kaardistab BaSISS kloon ruumiliselt seotud geneetilised variatsioonid mikrokeskkondades üksikutele kloonidele.

Järeldused

LCM, histoloogiaga juhitud proovivõtutehnika, ei anna vähi subklonaalsete piirkondade erapooletut esitust, eriti tervete kasvajaosade lõikes. BaSISS aga uuris suuri ruutsentimeetriseid koelõike, mis võimaldas uurida väiksemate kasvajate terveid ristlõikeid. See on ka suhteliselt odav ega tugine ainult WGS-põhistele meetoditele.

Kokkuvõtlikult võib öelda, et BaSISS on väärtuslik lisa ruumilise oomika tööriistakomplektile tänu oma märkimisväärsele võimele lokaliseerida ruumiliselt mitu erinevat vähi subklooni ja isegi iseloomustada neid molekulaarselt. Tulevikus võib selle laialdane kasutamine aidata paljastada, kuidas vähk erinevates kudedes kasvab, mis omakorda võib aidata leida kahetsusväärseid subkloone, mis põhjustavad ebasoodsaid kliinilisi tulemusi.

Viide:

• Lomakin, A. et al. (2022) „Räumliche Genomik bildet die Struktur, Natur und Entwicklung von Krebsklonen ab“, Nature. doi: 10.1038/s41586-022-05425-2. https://www.nature.com/articles/s41586-022-05425-2

.