Istraživači razvijaju novu metodu mapiranja prostornog razvoja raka

Istraživači razvijaju novu metodu mapiranja prostornog razvoja raka

U nedavno objavljenoj studiji u Priroda Istraživači su razvili tijek rada mapiranja genetskih klonova koji se fokusira na tehnologiju in situ sekvenciranja specifičnog za baze (BaSISS) za izvođenje kvantitativnih mapa višestrukih genetskih klonova stanica raka.

Lernen: Räumliche Genomik bildet die Struktur, Natur und Entwicklung von Krebsklonen ab. Bildnachweis: Lightspring/Shutterstock

pozadina

Kancerogene ili neoplastične stanice dinamične su cjeline koje se neprestano mijenjaju i preoblikuju u interakciji s mikrookolinom. Ove stanice imaju više subklonalnih populacija, koje su genetski povezane, ali različite skupine stanica.

Iako su genomske tehnologije kao što je sekvenciranje cijelog genoma (WGS) otkrile subklonove, čini se da ne mogu dešifrirati njihova fenotipska svojstva i interakcije unutar ekosustava tkiva. Ovo je glavno ograničenje jer su sve karakteristike subklonova raka determinante rasta, progresije, recidiva ili štetnih ishoda raka.

Tijek rada BaSISS-a

BaSISS je ciljao subklonove identificirane filogenetskim stablom izvedenim iz WGS-a. BaSISS sonde lokota specifične za mutaciju prvo su hibridizirane in situ s komplementarnom DNA (cDNA) iz mutantnih i divljeg tipa alela somatskih varijanti koje definiraju klon. Sve potpuno ciljane komplementarne sonde lokota povezane su i formiraju zatvorene krugove.

Naknadno, ispitivačke sonde označene fluoroforom i ciklička mikroskopija detektirali su jedinstvene barkodove čitača duge četiri do pet nukleotida iz ligiranih sondi koje su pojačane pojačavanjem u krugu kotrljajućeg kruga, što je omogućilo multipleksiranje. Tim je koristio matematičko modeliranje za izradu mapa klonova koristeći BaSISS signale i genotipove klonova.

O studiranju

U ovoj studiji istraživači su prikupili osam blokova tkiva od dvije pacijentice (P1 i P2) koje su podvrgnute kirurškoj mastektomiji zbog multifokalnog raka dojke. Ovi uzorci tkiva uključivali su tri histološka stadija rane progresije raka: duktalni karcinom in situ (DCIS), invazivni rak i metastaze u limfnim čvorovima.

Na tri uzorka P1, P1-estrogenskog receptora (ER)1, P1-ER2 i P1-D1, WGS eksperimenti identificirali su mutacijske klastere povezane sa šest filogenetskih grana stabla. BaSISS sonde s lokotom ciljale su 51 alel na svakoj filogenetskoj grani stabla. Tim je identificirao podklon na temelju identifikatora pacijenta i boje odgovarajućeg čvora filogenetskog stabla.

Točnije, različite boje označene na P1 označavaju čvor. B. P1-ljubičasta, P1-crvena, P1-siva, P1-narančasta, P1-zelena i P1-plava. Isto tako, genotip subklona uključivao je mutacije grana koje su se akumulirale kako se jedan kretao od korijena stabla do čvora subklona. Na primjer, P1 zelena sadržavala je sive, plave i zelene mutacije grananja.

Tim je ispitao tri uzorka primarnog raka dojke (PBC) s mješovitom invazivnom i DCIS histologijom: P1-ER1, P1-ER2 i P2 trostruko negativan (TN)1, kako bi pokazao da BaSISS može zabilježiti evoluciju različitih stadija raka kroz cijele dijelove tkiva. Osim toga, istraživači su integrirali prostorne podatke kako bi utvrdili kako su fenotipske promjene povezane s genetskim stanjem i prijelazima histoloških stanja.

Poznato je da je DCIS genetski heterogen, ali ostaje nejasno kako se DCIS klonovi organiziraju i rastu kroz širi sustav kanala. Stoga je tim ispitao tri DCIS uzorka iz P1 (P1-D1, P1-D2 i P1-D3) koji su obuhvaćali površinu tkiva od 224 mm2. Konačno, tim je proveo prostornu analizu ekspresije gena koristeći ciljano in situ sekvenciranje (ISS).

Rezultati studije

E-knjiga o genetici i genomici

Kompilacija najboljih intervjua, članaka i vijesti iz prošle godine. Preuzmite besplatnu kopiju

Gotovo 97% detektiranih BaSISS spot signala pretvoreno je u razumljive bar kodove. Njegova srednja ciljna specifična pokrivenost bila je 13 000 puta veća na 300 mm2 tkiva dojke. Nadalje, varijantne frakcije alela izvedene iz BaSISS-a pokazale su snažnu povezanost u repliciranim eksperimentima na serijskim presjecima tkiva, pokazujući njihovu kvantitativnu ponovljivost. BaSISS signali obojeni prema grani subklonske mutacije dali su vizualni uvid u strukturu subklonalnog rasta.

Algoritam za mapiranje klona također je diskretno prilagodio opažene frekvencije alela za niz pristranosti (npr. različita osjetljivost BaSISS sonde). Međutim, frekvencije alela modelirane BaSISS-om bile su u bliskom skladu s podacima laserske mikrodisekcije (LCM) i WGS-a.

U skladu s skupnim WGS podacima, BaSISS je otkrio dva do četiri subklona po PBC-u. Kvantitativno ispitivanje otkrilo je da su pojedinačni podklonovi formirali prostorne obrasce koji su bili povezani s histološkim napredovanjem stanja raka. Na primjer, u P1-ER2, regija s hiperplazijom nije genetski povezana s rakom, što je potvrdio LCM-WGS. U svim PBC-ima, genetski i histološki modeli progresije bili su uglavnom stabilni. Invazivni rak sastojao se prvenstveno od stanica iz nedavno divergiranog subklona.

Nasuprot tome, raniji divergentni klonovi potpuno ili djelomično kolokalizirani s DCIS-om. Međutim, jedan subklon u svakom PBC-u uključivao je i DCIS i invazivnu histologiju. Sugerirao je da također mogu postojati odvojeni histološki i genetski stadiji progresije. Primjeri uključuju klon P1-crveni u P1-ER1 i klon P1-ljubičasti u P1-ER2.

Što se tiče fenotipskih promjena povezanih s invazijom raka, istraživači su primijetili da mutirane klonske regije fosfataze i homologa tenzina (PTEN) imaju gušće Ki-67 imunohistokemijsko (IHC) nuklearno bojenje od divljih regija. Pojačana regulacija Ki-67, drugog genetskog klona, ​​bila je vremenski povezana sa stjecanjem mutacije PTEN i prethodila invaziji.

P1 narančaste epitelne stanice pokazale su veću ekspresiju onkogena regulatora staničnog ciklusa ciklina D1 (CCND1) i ciklina B1 (CCNB1) i onkogena proteina cinkovog prsta 3 (ZNF703), koji su bili povezani s nepovoljnim kliničkim ishodima. Sve u svemu, arhitektonski i nuklearni izgled i profili ekspresije gena bili su izrazito specifični za lozu, a njihovi različiti obrasci također su se mogli vizualizirati prostorno.

Analiza uzorka P2-LN1 s BaSISS-om otkrila je dva klona (P2-plavi i P2-narančasti) koji su formirali prostorno odvojene uzorke. Histološka anotacija korištenjem hematoksilina i eozina (H&E), limfocitnog zajedničkog antigena (CD45) i boja pan-citokeratina identificirala je višestruke obrasce metastatskog rasta raka. Autori su pronašli snažnu povezanost između ova dva otkrivena klona i njihovih histoloških obrazaca rasta.

Nadalje, otkrili su da su obrasci ekspresije gena 17/91 gena specifični za klon rekapitulirani unutar višestrukih, prostorno različitih opsega na više od 1 cm2 tumorskog tkiva. Sve u svemu, BaSISS klon preslikava prostorno povezane genetske varijacije u mikrookolišima na pojedinačne klonove.

Zaključci

LCM, tehnika uzorkovanja vođena histologijom, ne daje nepristran prikaz subklonskih područja raka, osobito u cijelim dijelovima tumora. BaSISS je, s druge strane, ispitivao velike presjeke tkiva kvadratnog centimetra, što je omogućilo pregled cijelih presjeka manjih tumora. Također je relativno jeftin i ne oslanja se isključivo na metode temeljene na WGS-u.

Ukratko, BaSISS je vrijedan dodatak kompletu alata za prostornu omiku zahvaljujući svojoj izvanrednoj sposobnosti da prostorno lokalizira više različitih subklonova raka i čak ih molekularno karakterizira. U budućnosti bi njegova raširena uporaba mogla pomoći u otkrivanju kako rak raste u različitim tkivima, što bi zauzvrat moglo pomoći u pronalaženju nesretnih subklonova koji uzrokuju nepovoljne kliničke ishode.

Referenca:

• Lomakin, A. et al. (2022) „Räumliche Genomik bildet die Struktur, Natur und Entwicklung von Krebsklonen ab“, Nature. doi: 10.1038/s41586-022-05425-2. https://www.nature.com/articles/s41586-022-05425-2

.