I ricercatori stanno sviluppando un nuovo metodo per mappare lo sviluppo spaziale del cancro

I ricercatori stanno sviluppando un nuovo metodo per mappare lo sviluppo spaziale del cancro

In uno studio recentemente pubblicato su Natura I ricercatori hanno sviluppato un flusso di lavoro di mappatura genetica dei cloni incentrato sulla tecnologia di sequenziamento in situ base-specifico (BaSISS) per ricavare mappe quantitative di più cloni genetici di cellule tumorali.

Lernen: Räumliche Genomik bildet die Struktur, Natur und Entwicklung von Krebsklonen ab. Bildnachweis: Lightspring/Shutterstock

sfondo

Le cellule cancerose o neoplastiche sono entità dinamiche che cambiano e rimodellano costantemente le loro interazioni con il loro microambiente. Queste cellule hanno più popolazioni subclonali, che sono gruppi di cellule geneticamente correlati ma distinti.

Sebbene le tecnologie genomiche come il sequenziamento dell’intero genoma (WGS) abbiano scoperto i subcloni, sembrano incapaci di decifrare le loro proprietà fenotipiche e le interazioni all’interno degli ecosistemi dei tessuti. Questa è una limitazione importante perché tutte le caratteristiche dei subcloni del cancro sono determinanti della crescita, della progressione, della recidiva o degli esiti avversi del cancro.

Flusso di lavoro BaSISS

I sottocloni mirati di BaSISS identificati da un albero filogenetico derivato da WGS. Le sonde a lucchetto BaSISS specifiche per la mutazione si sono ibridate per la prima volta in situ con DNA complementare (cDNA) da alleli mutanti e wild-type di varianti somatiche che definiscono il clone. Tutte le sonde per lucchetti complementari completamente mirate si sono legate e hanno formato cerchi chiusi.

Successivamente, le sonde di interrogazione marcate con fluoroforo e la microscopia ciclica hanno rilevato codici a barre unici, lunghi da quattro a cinque nucleotidi, provenienti da sonde legate che sono state amplificate mediante amplificazione a cerchio rotante, consentendo il multiplexing. Il team ha utilizzato la modellazione matematica per creare mappe di cloni utilizzando i segnali BaSISS e i genotipi dei cloni.

A proposito di studiare

Nel presente studio, i ricercatori hanno raccolto otto blocchi di tessuto da due pazienti (P1 e P2) sottoposti a mastectomia chirurgica per cancro al seno multifocale. Questi campioni di tessuto includevano tre stadi istologici di progressione precoce del cancro: carcinoma duttale in situ (DCIS), cancro invasivo e metastasi linfonodali.

Su tre campioni di P1, recettore P1 degli estrogeni (ER)1, P1-ER2 e P1-D1, gli esperimenti WGS hanno identificato cluster di mutazioni associati a sei rami di alberi filogenetici. Le sonde a lucchetto BaSISS hanno preso di mira 51 alleli su ciascun ramo dell'albero filogenetico. Il team ha identificato un sottoclone in base all’identificatore del paziente e al colore del corrispondente nodo dell’albero filogenetico.

Nello specifico, i diversi colori etichettati su P1 denotano un nodo. B. P1-viola, P1-rosso, P1-grigio, P1-arancione, P1-verde e P1-blu. Allo stesso modo, un genotipo di sottoclone includeva le mutazioni del ramo che si accumulavano quando ci si spostava dalla radice dell'albero al nodo del sottoclone. Ad esempio, il verde P1 conteneva mutazioni ramificate grigie, blu e verdi.

Il team ha esaminato tre campioni di cancro al seno primario (PBC) con istologia mista invasiva e DCIS: P1-ER1, P1-ER2 e P2 triplo negativo (TN)1, per dimostrare che BaSISS poteva registrare l’evoluzione dei diversi stadi del cancro in intere sezioni di tessuto. Inoltre, i ricercatori hanno integrato dati spaziali per determinare in che modo i cambiamenti fenotipici sono legati allo stato genetico e alle transizioni dello stato istologico.

È noto che il DCIS è geneticamente eterogeneo, ma il modo in cui i cloni DCIS si organizzano e crescono attraverso il sistema di canali più ampio rimane poco chiaro. Quindi il team ha esaminato tre campioni di DCIS da P1 (P1-D1, P1-D2 e P1-D3) che coprivano una superficie tissutale di 224 mm2. Infine, il team ha eseguito l'analisi dell'espressione genica spaziale utilizzando il sequenziamento mirato in situ (ISS).

Risultati dello studio

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Quasi il 97% dei segnali spot BaSISS rilevati sono stati convertiti in codici a barre comprensibili. La sua copertura media specifica per l’obiettivo era 13.000 volte superiore per 300 mm2 di tessuto mammario. Inoltre, le frazioni alleliche varianti derivate da BaSISS hanno mostrato una forte associazione attraverso esperimenti replicati su sezioni di tessuto seriali, dimostrando la loro riproducibilità quantitativa. I segnali BaSISS colorati in base al ramo di mutazione subclonale hanno mostrato una visione visiva della struttura di crescita subclonale.

L'algoritmo di mappatura del clone ha inoltre regolato in modo discreto le frequenze alleliche osservate per una serie di bias (ad esempio, diversa sensibilità della sonda BaSISS). Tuttavia, le frequenze alleliche modellate da BaSISS erano in stretto accordo con la microdissezione con cattura laser (LCM) e i dati di convalida WGS.

Coerentemente con i dati WGS di massa, BaSISS ha rilevato da due a quattro sottocloni per PBC. L'esame quantitativo ha rivelato che i singoli sottocloni formavano modelli spaziali correlati alla progressione istologica degli stati tumorali. Ad esempio, in P1-ER2, una regione con iperplasia non era geneticamente correlata al cancro, come confermato da LCM-WGS. In tutte le PBC, i modelli di progressione genetica e istologica erano in gran parte stabili. Il cancro invasivo era costituito principalmente da cellule del subclone divergente più recentemente.

Al contrario, i precedenti cloni divergenti si sono colocalizzati completamente o parzialmente con il DCIS. Tuttavia, un subclone in ciascun PBC includeva sia il DCIS che l'istologia invasiva. Ha suggerito che potrebbero esistere anche stadi di progressione istologica e genetica separati. Gli esempi includono il clone P1-rosso in P1-ER1 e il clone P1-viola in P1-ER2.

Per quanto riguarda i cambiamenti fenotipici associati all'invasione del cancro, i ricercatori hanno osservato che le regioni clonali mutanti dell'omologo della fosfatasi e della tensina (PTEN) avevano una colorazione nucleare immunoistochimica (IHC) Ki-67 più densa rispetto alle regioni wild-type. La sovraregolazione di Ki-67, un altro clone genetico, era temporalmente correlata all'acquisizione di una mutazione PTEN e precedeva l'invasione.

Le cellule epiteliali arancioni P1 hanno mostrato una maggiore espressione degli oncogeni regolatori del ciclo cellulare ciclina D1 (CCND1) e ciclina B1 (CCNB1) e dell'oncogene zinc finger protein 3 (ZNF703), che sono stati associati a esiti clinici avversi. Nel complesso, l'aspetto architettonico e nucleare e i profili di espressione genetica erano notevolmente specifici del lignaggio e i loro modelli distinti potevano essere visualizzati anche spazialmente.

L'analisi del campione P2-LN1 con BaSISS ha scoperto due cloni (P2-blu e P2-arancione) che formavano modelli spazialmente separati. L'annotazione istologica utilizzando ematossilina ed eosina (H&E), antigene comune dei linfociti (CD45) e macchie pan-citocheratina ha identificato molteplici modelli di crescita del cancro metastatico. Gli autori hanno trovato forti associazioni tra questi due cloni scoperti e i loro modelli di crescita istologici.

Inoltre, hanno scoperto che i modelli di espressione genica specifici del clone di 17/91 geni erano ricapitolati in estensioni multiple e spazialmente distinte su più di 1 cm2 di tessuto tumorale. Nel complesso, il clone BaSISS mappa le variazioni genetiche spazialmente correlate nei microambienti ai singoli cloni.

Conclusioni

LCM, una tecnica di campionamento guidata dall'istologia, non fornisce una rappresentazione imparziale delle aree subclonali del cancro, in particolare attraverso intere sezioni tumorali. BaSISS, invece, ha esaminato sezioni di tessuto di grandi centimetri quadrati, che hanno permesso di esaminare intere sezioni trasversali di tumori più piccoli. È anche relativamente economico e non si basa esclusivamente su metodi basati su WGS.

In sintesi, BaSISS rappresenta una preziosa aggiunta al kit di strumenti di omica spaziale grazie alla sua notevole capacità di localizzare spazialmente più sottocloni tumorali distinti e persino di caratterizzarli a livello molecolare. In futuro, il suo utilizzo diffuso potrebbe aiutare a rivelare come il cancro cresce nei diversi tessuti, il che a sua volta potrebbe aiutare a rintracciare gli sfortunati sottocloni che causano esiti clinici avversi.

Riferimento:

• Lomakin, A. et al. (2022) „Räumliche Genomik bildet die Struktur, Natur und Entwicklung von Krebsklonen ab“, Nature. doi: 10.1038/s41586-022-05425-2. https://www.nature.com/articles/s41586-022-05425-2

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