Pētnieki izstrādā jaunu metodi vēža telpiskās attīstības kartēšanai

Pētnieki izstrādā jaunu metodi vēža telpiskās attīstības kartēšanai

Nesen publicētā pētījumā Daba Pētnieki izstrādāja ģenētisko klonu kartēšanas darbplūsmu, kas koncentrējas uz bāzes specifisko in situ sekvencēšanas (BaSISS) tehnoloģiju, lai iegūtu daudzu vēža šūnu ģenētisko klonu kvantitatīvās kartes.

Lernen: Räumliche Genomik bildet die Struktur, Natur und Entwicklung von Krebsklonen ab. Bildnachweis: Lightspring/Shutterstock

fons

Vēža vai neoplastiskas šūnas ir dinamiskas vienības, kas pastāvīgi mainās un pārveido savu mijiedarbību ar savu mikrovidi. Šīm šūnām ir vairākas subklonālas populācijas, kas ir ģenētiski saistītas, bet atšķirīgas šūnu grupas.

Lai gan genoma tehnoloģijas, piemēram, visa genoma sekvencēšana (WGS), ir atklājušas subklonus, šķiet, ka tie nespēj atšifrēt to fenotipiskās īpašības un mijiedarbību audu ekosistēmās. Tas ir būtisks ierobežojums, jo visas vēža subklonu īpašības ir vēža augšanas, progresēšanas, atkārtošanās vai nelabvēlīgu iznākumu noteicošie faktori.

BaSISS darbplūsma

BaSISS mērķa subkloni, kas identificēti ar WGS atvasinātu filoģenētisko koku. BaSISS mutācijām specifiskās piekaramo atslēgu zondes vispirms hibridizējās in situ ar komplementāru DNS (cDNS) no mutantu un savvaļas tipa alēļu klonus definējošo somatisko variantu. Visas pilnībā mērķētās komplementārās piekaramo atslēgu zondes tika sasietas un veidoja slēgtus apļus.

Pēc tam ar fluoroforu iezīmētās pratināšanas zondes un cikliskā mikroskopija atklāja unikālus četru līdz piecu nukleotīdu garus lasītāja svītrkodus no ligētām zondēm, kas tika pastiprināti ar ritošā apļa pastiprināšanu, ļaujot multipleksēt. Komanda izmantoja matemātisko modelēšanu, lai izveidotu klonu kartes, izmantojot BaSISS signālus un klonu genotipus.

Par mācībām

Šajā pētījumā pētnieki savāca astoņus audu blokus no diviem pacientiem (P1 un P2), kuriem tika veikta ķirurģiska mastektomija multifokāla krūts vēža gadījumā. Šajos audu paraugos bija trīs agrīnas vēža progresēšanas histoloģiskie posmi: ductal carcinoma in situ (DCIS), invazīvs vēzis un limfmezglu metastāzes.

Trīs P1, P1-estrogēnu receptoru (ER)1, P1-ER2 un P1-D1 paraugos WGS eksperimenti identificēja mutāciju kopas, kas saistītas ar sešiem filoģenētiskiem koku zariem. BaSISS piekaramo atslēgu zondes mērķēja uz 51 alēli katrā filoģenētiskā koka zarā. Komanda identificēja subklonu, pamatojoties uz pacienta identifikatoru un atbilstošā filoģenētiskā koka mezgla krāsu.

Konkrēti, dažādas krāsas, kas apzīmētas uz P1, apzīmē mezglu. B. P1-violeta, P1-sarkana, P1-pelēka, P1-oranža, P1-zaļa un P1-zila. Tāpat subklona genotips ietvēra zaru mutācijas, kas uzkrājās, pārvietojoties no koka saknes uz subklona mezglu. Piemēram, P1 zaļā krāsa saturēja pelēkas, zilas un zaļas zaru mutācijas.

Komanda pārbaudīja trīs primārā krūts vēža (PBC) paraugus ar jauktu invazīvu un DCIS histoloģiju: P1-ER1, P1-ER2 un P2 trīskārši negatīvu (TN)1, lai parādītu, ka BaSISS var reģistrēt dažādu vēža stadiju attīstību visās audu sekcijās. Turklāt pētnieki integrēja telpiskos datus, lai noteiktu, kā fenotipiskās izmaiņas ir saistītas ar ģenētisko stāvokli un histoloģiskā stāvokļa pārejām.

Ir zināms, ka DCIS ir ģenētiski neviendabīgs, taču joprojām nav skaidrs, kā DCIS kloni organizējas un aug caur plašāku kanālu sistēmu. Tāpēc komanda pārbaudīja trīs DCIS paraugus no P1 (P1-D1, P1-D2 un P1-D3), kas aptvēra audu virsmas laukumu 224 mm2. Visbeidzot, komanda veica telpisko gēnu ekspresijas analīzi, izmantojot mērķtiecīgu in situ sekvencēšanu (ISS).

Studiju rezultāti

Ģenētika un genomika e-grāmata

Pagājušā gada populārāko interviju, rakstu un ziņu apkopojums. Lejupielādējiet bezmaksas kopiju

Gandrīz 97% no atklātajiem BaSISS vietas signāliem tika pārveidoti saprotamos svītrkodos. Tās vidējais mērķa specifiskais pārklājums bija 13 000 reižu lielāks uz 300 mm2 krūšu audu. Turklāt variantu alēļu frakcijas, kas iegūtas no BaSISS, uzrādīja spēcīgu saistību starp atkārtotajiem eksperimentiem ar sērijveida audu sekcijām, parādot to kvantitatīvo reproducējamību. BaSISS signāli, kas krāsoti atbilstoši to subklonālās mutācijas nozarei, parādīja vizuālu ieskatu subklonālās augšanas struktūrā.

Klonu kartēšanas algoritms arī diskrēti koriģēja novērotās alēļu frekvences vairākām novirzēm (piemēram, atšķirīgai BaSISS zondes jutībai). Tomēr BaSISS modelētās alēļu frekvences cieši saskanēja ar lāzera uztveršanas mikrodissekciju (LCM) un WGS validācijas datiem.

Saskaņā ar lielapjoma WGS datiem, BaSISS atklāja divus līdz četrus subklonus uz vienu PBC. Kvantitatīvā pārbaude atklāja, ka atsevišķi subkloni veidoja telpiskus modeļus, kas bija saistīti ar vēža stāvokļu histoloģisko progresēšanu. Piemēram, P1-ER2 reģions ar hiperplāziju nebija ģenētiski saistīts ar vēzi, kā apstiprināja LCM-WGS. Visos PBC ģenētiskie un histoloģiskie progresēšanas modeļi lielākoties bija stabili. Invazīvais vēzis galvenokārt sastāvēja no šūnām no pēdējā atšķirīgā subklona.

Un otrādi, agrākie atšķirīgie kloni pilnībā vai daļēji kolokalizēti ar DCIS. Tomēr viens subklons katrā PBC ietvēra gan DCIS, gan invazīvo histoloģiju. Tas liecināja, ka var pastāvēt arī atsevišķas histoloģiskas un ģenētiskas progresēšanas stadijas. Piemēri ietver klonu P1-sarkanu P1-ER1 un klonu P1-purpuru P1-ER2.

Attiecībā uz fenotipiskām izmaiņām, kas saistītas ar vēža invāziju, pētnieki novēroja, ka fosfatāzes un tenzīna homologa (PTEN) mutantu klonālajiem reģioniem bija blīvāka Ki-67 imūnhistoķīmijas (IHC) kodolkrāsošanās nekā savvaļas tipa reģionos. Ki-67, cita ģenētiskā klona, ​​regulēšana bija īslaicīgi saistīta ar PTEN mutācijas iegūšanu un pirms invāzijas.

P1 oranžās epitēlija šūnas uzrādīja augstāku šūnu ciklu regulējošo onkogēnu ciklin D1 (CCND1) un ciklīna B1 (CCNB1) un onkogēna cinka pirksta proteīna 3 (ZNF703) ekspresiju, kas bija saistīti ar nelabvēlīgiem klīniskiem rezultātiem. Kopumā arhitektūras un kodolu izskats un gēnu ekspresijas profili bija ļoti specifiski ciltsrakstiem, un to atšķirīgos modeļus varēja arī vizualizēt telpiski.

P2-LN1 parauga analīze ar BaSISS atklāja divus klonus (P2-zils un P2-oranžs), kas veidoja telpiski atsevišķus modeļus. Histoloģiskā anotācija, izmantojot hematoksilīnu un eozīnu (H&E), limfocītu kopējo antigēnu (CD45) un pan-citokeratīna traipus, identificēja vairākus metastātiskus vēža augšanas modeļus. Autori atklāja spēcīgas asociācijas starp šiem diviem atklātajiem kloniem un to histoloģiskajiem augšanas modeļiem.

Turklāt viņi atklāja, ka 17/91 gēnu klonam specifiskie gēnu ekspresijas modeļi tika apkopoti vairākos, telpiski atšķirīgos apmēros vairāk nekā 1 cm2 audzēja audu. Kopumā BaSISS klons kartē telpiski saistītas ģenētiskās variācijas mikrovidē uz atsevišķiem kloniem.

Secinājumi

LCM, histoloģijas vadīta paraugu ņemšanas metode, nenodrošina objektīvu vēža subklonālo zonu attēlojumu, jo īpaši visās audzēja sekcijās. Savukārt BaSISS izmeklēja lielas kvadrātcentimetru audu sekcijas, kas ļāva izmeklēt veselus mazāku audzēju šķērsgriezumus. Tas ir arī salīdzinoši lēts un nepaļaujas tikai uz WGS metodēm.

Rezumējot, BaSISS ir vērtīgs papildinājums telpiskās omikas rīku komplektam, pateicoties tā ievērojamajai spējai telpiski lokalizēt vairākus atšķirīgus vēža subklonus un pat raksturot tos molekulāri. Nākotnē tā plaši izplatītā izmantošana varētu palīdzēt atklāt, kā vēzis aug dažādos audos, kas savukārt varētu palīdzēt izsekot nelaimīgajiem subkloniem, kas izraisa nelabvēlīgus klīniskos rezultātus.

Atsauce:

• Lomakin, A. et al. (2022) „Räumliche Genomik bildet die Struktur, Natur und Entwicklung von Krebsklonen ab“, Nature. doi: 10.1038/s41586-022-05425-2. https://www.nature.com/articles/s41586-022-05425-2

.