Forskere utvikler en ny metode for å kartlegge den romlige utviklingen av kreft

Forskere utvikler en ny metode for å kartlegge den romlige utviklingen av kreft

I en nylig publisert studie i Natur Forskere utviklet en arbeidsflyt for genetisk klonkartlegging som fokuserer på basespesifikk in situ-sekvensering (BaSISS) teknologi for å utlede kvantitative kart over flere genetiske kloner av kreftceller.

Lernen: Räumliche Genomik bildet die Struktur, Natur und Entwicklung von Krebsklonen ab. Bildnachweis: Lightspring/Shutterstock

bakgrunn

Kreftceller eller neoplastiske celler er dynamiske enheter som hele tiden endrer og omformer deres interaksjoner med mikromiljøet. Disse cellene har flere subklonale populasjoner, som er genetisk beslektede, men distinkte grupper av celler.

Selv om genomiske teknologier som helgenomsekvensering (WGS) har oppdaget subkloner, ser det ut til at de ikke er i stand til å dechiffrere deres fenotypiske egenskaper og interaksjoner i vevsøkosystemer. Dette er en stor begrensning fordi alle kjennetegn ved kreftsubkloner er determinanter for kreftvekst, progresjon, tilbakefall eller uønskede utfall.

BasISS arbeidsflyt

BaSISS målrettet subkloner identifisert av et WGS-avledet fylogenetisk tre. BaSISS mutasjonsspesifikke hengelåsprober hybridiserte først in situ med komplementært DNA (cDNA) fra mutante og villtype alleler av klondefinerende somatiske varianter. Alle fullt målrettede komplementære hengelåsprober lignet og dannet lukkede sirkler.

Deretter oppdaget fluorofor-merkede avhørsprober og syklisk mikroskopi unike fire- til fem-nukleotider lange leserstrekkoder fra ligerte prober som ble amplifisert ved rullende sirkelamplifisering, noe som muliggjorde multipleksing. Teamet brukte matematisk modellering for å lage klonekart ved å bruke BaSISS-signaler og klonegenotypene.

Om å studere

I denne studien samlet forskerne åtte vevsblokker fra to pasienter (P1 og P2) som gjennomgikk kirurgisk mastektomi for multifokal brystkreft. Disse vevsprøvene inkluderte tre histologiske stadier av tidlig kreftprogresjon: duktalt karsinom in situ (DCIS), invasiv kreft og lymfeknutemetastaser.

På tre prøver av P1, P1-østrogenreseptor (ER)1, P1-ER2 og P1-D1, identifiserte WGS-eksperimenter mutasjonsklynger assosiert med seks fylogenetiske tregrener. BaSISS hengelåsprober målrettet mot 51 alleler på hver fylogenetisk tregren. Teamet identifiserte en subklon basert på en pasientidentifikator og fargen på den tilsvarende fylogenetiske trenoden.

Spesielt, forskjellige farger merket på P1 angir en node. B. P1-lilla, P1-rød, P1-grå, P1-oransje, P1-grønn og P1-blå. På samme måte inkluderte en subklon-genotype grenmutasjonene som akkumulerte når man flyttet fra treroten til subklonoden. For eksempel inneholdt P1 grønn grå, blå og grønne forgreningsmutasjoner.

Teamet undersøkte tre prøver av primær brystkreft (PBC) med blandet invasiv og DCIS-histologi: P1-ER1, P1-ER2 og P2 trippelnegative (TN)1, for å vise at BaSISS kunne registrere utviklingen av forskjellige kreftstadier over hele vevsseksjoner. I tillegg integrerte forskere romlige data for å bestemme hvordan fenotypiske endringer er relatert til genetisk tilstand og histologiske tilstandsoverganger.

DCIS er kjent for å være genetisk heterogen, men hvordan DCIS-kloner organiserer seg og vokser gjennom det bredere kanalsystemet er fortsatt uklart. Så teamet undersøkte tre DCIS-prøver fra P1 (P1-D1, P1-D2 og P1-D3) som spenner over et vevsoverflateareal på 224 mm2. Til slutt utførte teamet romlig genekspresjonsanalyse ved å bruke målrettet in situ-sekvensering (ISS).

Studieresultater

Genetikk og genomikk eBok

Sammenstilling av de beste intervjuene, artikler og nyheter fra det siste året. Last ned en gratis kopi

Nesten 97 % av de oppdagede BaSISS-punktsignalene ble konvertert til forståelige strekkoder. Dens gjennomsnittlige målspesifikke dekning var 13 000 ganger høyere per 300 mm2 brystvev. Videre viste variant-allelfraksjonene avledet fra BaSISS sterk assosiasjon på tvers av replikateksperimenter på serielle vevssnitt, noe som demonstrerte deres kvantitative reproduserbarhet. BaSISS-signalene farget i henhold til deres subklonale mutasjonsgren viste en visuell innsikt i den subklonale vekststrukturen.

Klonkartleggingsalgoritmen justerte også diskret de observerte allelfrekvensene for en rekke skjevheter (f.eks. ulik sensitivitet til BaSISS-sonden). Imidlertid var de BaSISS-modellerte allelfrekvensene i nær overensstemmelse med laserfangstmikrodisseksjon (LCM) og WGS-valideringsdata.

I samsvar med bulk WGS-data, oppdaget BaSISS to til fire subkloner per PBC. Kvantitativ undersøkelse avslørte at individuelle subkloner dannet romlige mønstre som var relatert til histologisk progresjon av krefttilstander. For eksempel, i P1-ER2, var en region med hyperplasi ikke genetisk relatert til kreft, som bekreftet av LCM-WGS. I alle PBC var de genetiske og histologiske progresjonsmodellene stort sett stabile. Den invasive kreften besto primært av celler fra den sist divergerte subklonen.

Omvendt koloniserte tidligere divergerende kloner helt eller delvis med DCIS. En subklon i hver PBC inkluderte imidlertid både DCIS og invasiv histologi. Det antydet at separate histologiske og genetiske progresjonsstadier også kan eksistere. Eksempler inkluderer klon P1-rød i P1-ER1 og klon P1-lilla i P1-ER2.

Når det gjelder fenotypiske endringer assosiert med kreftinvasjon, observerte forskere at fosfatase- og tensinhomolog (PTEN) mutante klonale regioner hadde tettere Ki-67 immunhistokjemi (IHC) kjernefarging enn villtyperegioner. Oppregulering av Ki-67, en annen genetisk klon, var tidsmessig relatert til anskaffelsen av en PTEN-mutasjon og gikk foran invasjonen.

P1 oransje epitelceller viste høyere uttrykk for de cellesyklusregulerende onkogenene cyclin D1 (CCND1) og cyclin B1 (CCNB1) og onkogenet sinkfingerprotein 3 (ZNF703), som var assosiert med uønskede kliniske utfall. Totalt sett var arkitektoniske og kjernefysiske utseende og genuttrykksprofiler bemerkelsesverdig avstamningsspesifikke, og deres distinkte mønstre kunne også visualiseres romlig.

Analyse av prøve P2-LN1 med BaSISS oppdaget to kloner (P2-blå og P2-oransje) som dannet romlig separate mønstre. Histologisk annotering ved bruk av hematoxylin&eosin (H&E), lymfocytt vanlig antigen (CD45) og pan-cytokeratin-flekker identifiserte flere metastatiske kreftvekstmønstre. Forfatterne fant sterke assosiasjoner mellom disse to oppdagede klonene og deres histologiske vekstmønstre.

Videre fant de at klonspesifikke genuttrykksmønstre av 17/91 gener ble rekapitulert innenfor flere, romlig distinkte utstrekninger over mer enn 1 cm2 av tumorvev. Totalt sett kartlegger BaSISS-klonen romlig relaterte genetiske variasjoner i mikromiljøer til individuelle kloner.

Konklusjoner

LCM, en histologiveiledet prøvetakingsteknikk, gir ikke en objektiv representasjon av kreftsubklonale områder, spesielt på tvers av hele tumorseksjoner. BaSISS på sin side undersøkte store kvadratcentimeter vevssnitt, noe som gjorde det mulig å undersøke hele tverrsnitt av mindre svulster. Det er også relativt billig og er ikke utelukkende avhengig av WGS-baserte metoder.

Oppsummert er BaSISS et verdifullt tillegg til det romlige omics-verktøysettet takket være dets bemerkelsesverdige evne til romlig lokalisere flere distinkte kreftsubkloner og til og med karakterisere dem molekylært. I fremtiden kan den utbredte bruken bidra til å avsløre hvordan kreft vokser i forskjellige vev, noe som igjen kan bidra til å spore opp de uheldige subklonene som forårsaker uheldige kliniske utfall.

Referanse:

• Lomakin, A. et al. (2022) „Räumliche Genomik bildet die Struktur, Natur und Entwicklung von Krebsklonen ab“, Nature. doi: 10.1038/s41586-022-05425-2. https://www.nature.com/articles/s41586-022-05425-2

.