Forskare utvecklar en ny metod för att kartlägga den rumsliga utvecklingen av cancer

Forskare utvecklar en ny metod för att kartlägga den rumsliga utvecklingen av cancer

I en nyligen publicerad studie i Natur Forskare utvecklade ett arbetsflöde för genetisk klonkartläggning som fokuserar på basspecifik in situ-sekvensering (BaSISS) teknologi för att härleda kvantitativa kartor över flera genetiska kloner av cancerceller.

Lernen: Räumliche Genomik bildet die Struktur, Natur und Entwicklung von Krebsklonen ab. Bildnachweis: Lightspring/Shutterstock

bakgrund

Cancerceller eller neoplastiska celler är dynamiska enheter som ständigt förändras och omformar sina interaktioner med sin mikromiljö. Dessa celler har flera subklonala populationer, som är genetiskt relaterade men distinkta grupper av celler.

Även om genomiska teknologier som helgenomsekvensering (WGS) har upptäckt subkloner, verkar de oförmögna att dechiffrera deras fenotypiska egenskaper och interaktioner inom vävnadsekosystem. Detta är en stor begränsning eftersom alla egenskaper hos cancersubkloner är determinanter för cancertillväxt, progression, återfall eller ogynnsamma resultat.

BasISS arbetsflöde

BaSISS riktade sig mot subkloner identifierade av ett WGS-härlett fylogenetiskt träd. BaSISS mutationsspecifika hänglåsprober hybridiserade först in situ med komplementärt DNA (cDNA) från muterade och vildtypsalleler av klondefinierande somatiska varianter. Alla fullt riktade komplementära hänglåssonder ligerade och bildade slutna cirklar.

Därefter upptäckte fluoroformärkta förhörsprober och cyklisk mikroskopi unika fyra till fem nukleotider långa läsarstreckkoder från ligerade prober som amplifierades genom rullande cirkelamplifiering, vilket möjliggjorde multiplexering. Teamet använde matematisk modellering för att skapa klonkartor med hjälp av BaSISS-signaler och klongenotyper.

Om att studera

I den aktuella studien samlade forskarna åtta vävnadsblock från två patienter (P1 och P2) som genomgick kirurgisk mastektomi för multifokal bröstcancer. Dessa vävnadsprover inkluderade tre histologiska stadier av tidig cancerprogression: ductal carcinoma in situ (DCIS), invasiv cancer och lymfkörtelmetastaser.

På tre prover av P1, P1-östrogenreceptor (ER)1, P1-ER2 och P1-D1, identifierade WGS-experiment mutationskluster associerade med sex fylogenetiska trädgrenar. BaSISS hänglåssonder riktade sig mot 51 alleler på varje fylogenetisk trädgren. Teamet identifierade en subklon baserat på en patientidentifierare och färgen på motsvarande fylogenetiska trädnod.

Specifikt anger olika färger märkta på P1 en nod. B. P1-lila, P1-röd, P1-grå, P1-orange, P1-grön och P1-blå. På samma sätt inkluderade en subklongenotyp de grenmutationer som ackumulerades när man flyttade från trädroten till subklonnoden. Till exempel innehöll P1-grönt grå, blå och grön grenmutationer.

Teamet undersökte tre primära bröstcancer (PBC) prover med blandad invasiv och DCIS histologi: P1-ER1, P1-ER2 och P2 triple-negative (TN)1, för att visa att BaSISS kunde registrera utvecklingen av olika cancerstadier över hela vävnadssnitt. Dessutom integrerade forskare rumsliga data för att bestämma hur fenotypiska förändringar är relaterade till genetiskt tillstånd och histologiska tillståndsövergångar.

DCIS är känt för att vara genetiskt heterogen, men hur DCIS-kloner organiserar sig och växer genom det bredare kanalsystemet är fortfarande oklart. Så teamet undersökte tre DCIS-prover från P1 (P1-D1, P1-D2 och P1-D3) som sträckte sig över en vävnadsyta på 224 mm2. Slutligen utförde teamet rumslig genuttrycksanalys med hjälp av riktad in situ-sekvensering (ISS).

Studieresultat

Genetik och genomik e-bok

Sammanställning av de bästa intervjuerna, artiklarna och nyheterna från det senaste året. Ladda ner en gratis kopia

Nästan 97 % av de upptäckta BaSISS-fläcksignalerna omvandlades till förståeliga streckkoder. Dess genomsnittliga målspecifika täckning var 13 000 gånger högre per 300 mm2 bröstvävnad. Dessutom visade variantallelfraktionerna härledda från BaSISS stark association över replikatexperiment på seriella vävnadssnitt, vilket visar deras kvantitativa reproducerbarhet. BaSISS-signalerna färgade enligt deras subklonala mutationsgren visade en visuell insikt i den subklonala tillväxtstrukturen.

Klonkartläggningsalgoritmen justerade också diskret de observerade allelfrekvenserna för ett antal fördomar (t.ex. olika känslighet för BaSISS-sonden). Men de BaSISS-modellerade allelfrekvenserna var i nära överensstämmelse med laserinfångningsmikrodissektion (LCM) och WGS-valideringsdata.

I enlighet med bulk WGS-data upptäckte BaSISS två till fyra subkloner per PBC. Kvantitativ undersökning visade att individuella subkloner bildade rumsliga mönster som var relaterade till den histologiska utvecklingen av cancertillstånd. Till exempel, i P1-ER2, var en region med hyperplasi inte genetiskt relaterad till cancer, vilket bekräftas av LCM-WGS. I alla PBC var de genetiska och histologiska progressionsmodellerna i stort sett stabila. Den invasiva cancern bestod främst av celler från den senast divergerade subklonen.

Omvänt kolokaliserade tidigare divergerande kloner helt eller delvis med DCIS. En subklon i varje PBC inkluderade emellertid både DCIS och invasiv histologi. Det föreslog att separata histologiska och genetiska progressionsstadier också kan existera. Exempel inkluderar klon P1-röd i Pl-ER1 och klon Pl-lila i Pl-ER2.

När det gäller fenotypiska förändringar associerade med cancerinvasion, observerade forskare att fosfatas- och tensinhomolog (PTEN) muterade klonala regioner hade tätare Ki-67 immunhistokemi (IHC) nukleär färgning än vildtypsregioner. Uppreglering av Ki-67, en annan genetisk klon, var tidsmässigt relaterad till förvärvet av en PTEN-mutation och föregick invasion.

P1 orange epitelceller visade högre uttryck av cellcykelreglerande onkogener cyklin D1 (CCND1) och cyklin B1 (CCNB1) och onkogen zinkfingerprotein 3 (ZNF703), som var associerade med negativa kliniska resultat. Sammantaget var arkitektoniska och nukleära utseenden och genuttrycksprofiler anmärkningsvärt härstamningsspecifika, och deras distinkta mönster kunde också visualiseras rumsligt.

Analys av prov P2-LN1 med BaSISS upptäckte två kloner (P2-blå och P2-orange) som bildade rumsligt separata mönster. Histologiska anteckningar med användning av hematoxylin&eosin (H&E), lymfocyt-vanligt antigen (CD45) och pan-cytokeratin-fläckar identifierade flera metastaserande cancertillväxtmönster. Författarna fann starka samband mellan dessa två upptäckta kloner och deras histologiska tillväxtmönster.

Vidare fann de att klonspecifika genuttrycksmönster för 17/91-gener recapitulerades inom flera, rumsligt distinkta omfattningar över mer än 1 cm2 tumörvävnad. Sammantaget kartlägger BaSISS-klonen rumsligt relaterade genetiska variationer i mikromiljöer till enskilda kloner.

Slutsatser

LCM, en histologistyrd provtagningsteknik, ger inte en opartisk representation av cancer subklonala områden, särskilt över hela tumörsektioner. BaSISS å sin sida undersökte stora kvadratcentimeter vävnadssnitt, vilket gjorde det möjligt att undersöka hela tvärsnitt av mindre tumörer. Det är också relativt billigt och förlitar sig inte enbart på WGS-baserade metoder.

Sammanfattningsvis är BaSISS ett värdefullt tillägg till den rumsliga omics-verktygslådan tack vare dess anmärkningsvärda förmåga att rumsligt lokalisera flera distinkta cancersubkloner och till och med karakterisera dem molekylärt. I framtiden kan dess utbredda användning hjälpa till att avslöja hur cancer växer i olika vävnader, vilket i sin tur kan hjälpa till att spåra de olyckliga subkloner som orsakar negativa kliniska resultat.

Hänvisning:

• Lomakin, A. et al. (2022) „Räumliche Genomik bildet die Struktur, Natur und Entwicklung von Krebsklonen ab“, Nature. doi: 10.1038/s41586-022-05425-2. https://www.nature.com/articles/s41586-022-05425-2

.