Použitie technológie CRISPR/Cas na boj proti antimikrobiálnej rezistencii

Použitie technológie CRISPR/Cas na boj proti antimikrobiálnej rezistencii

V druhej novej výskumnej správe na túto tému asistent profesor Ibrahim Bitar hovorí: Mikrobiologická klinika LFUK a FN Plzeň, Univerzita Karlova Praha, Plzeň, Česká republika, poskytne prehľad molekulárnej biológie technológie CRISPR a vysvetlí, ako ju možno použiť v boji proti antimikrobiálnej rezistencii.

Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) a gény spojené s CRISPR (Cas) sú rozšírené v genóme mnohých baktérií a predstavujú obranný mechanizmus proti cudzím útočníkom, ako sú plazmidy a vírusy. Pole CRISPR pozostávajú z opakovaného usporiadania krátkych sekvencií, z ktorých každá je odvodená a presne zodpovedá sekvencii nukleovej kyseliny, ktorá raz napadla hostiteľa.

Sekvencie CRISPR sprevádza 4–10 génov spojených s CRISPR (cas), ktoré sú vysoko konzervované a kódujú proteíny Cas. Proteíny Cas vykonávajú adaptívnu imunitu u prokaryotov (baktérií) na základe imunologických spomienok uložených v poli CRISPR. Systém CRISPR/Cas integruje malý kúsok cudzej DNA z útočníkov, ako sú plazmidy a vírusy, do ich priamych opakovaných sekvencií a počas budúcich invázií rozpozná a degraduje rovnaké vonkajšie prvky DNA.

Pretože systémy CRISPR/Cas integrujú DNA z inváznych patogénov v chronickom poradí, genotypizácia sa môže použiť na sledovanie klonality a pôvodu izolátov a ich definovanie ako populácie kmeňov, ktoré boli vystavené rovnakým podmienkam prostredia vrátane geografickej polohy (regiónu). ) a komunitných / nemocničných prostrediach a nakoniec sa ďalej rozšírili na sledovanie patogénnych baktérií v ľudskej spoločnosti.

Systémy CRISPR/Cas možno použiť aj na vývoj antimikrobiálnych činidiel: zavedením samocieliacich crRNA sa cieľové bakteriálne populácie účinne a selektívne zabíjajú. Kvôli nedostatku dostupných účinných antimikrobiálnych činidiel na liečbu multirezistentných (MDR) infekcií začali výskumníci hľadať alternatívne metódy boja proti MDR infekciám namiesto toho, aby prešli procesom vývoja nových antimikrobiálnych činidiel, ktorý môže trvať desaťročia. Výsledkom bolo, že koncept selektívnych antimikrobiálnych látok na báze CRISPR/Cas bol prvýkrát vyvinutý a demonštrovaný v roku 2014. Vektory kódujúce Cas9 a vodiace RNA zacielené na genómové lokusy špecifického bakteriálneho kmeňa/druhu môžu byť dodané do cieľového kmeňa prostredníctvom bakteriofágov alebo konjugačných bakteriálnych kmeňov. Teoreticky poskytovanie manipulovaných systémov CRISPR/Cas špecificky eliminuje cieľové kmene z bakteriálnej populácie, ale nie je to také jednoduché.

Zatiaľ čo tieto systémy môžu byť cieľom manipulácie/interferencie, všetky baktérie sú regulované viacerými spôsobmi, aby sa zabezpečilo, že baktérie zostanú pod kontrolou procesu. Preto stále existuje niekoľko veľkých problémov pri používaní tohto systému ako antimikrobiálneho činidla.

Väčšina metód vyžaduje dodanie resenzibilizovaného systému konjugáciou; Vektor je prenášaný nevirulentným laboratórnym kmeňom baktérií, ktorý je navrhnutý tak, aby zdieľal vektor/plazmid konjugáciou. Proces konjugácie je prirodzený proces, ktorý baktérie vykonávajú a ktorého výsledkom je vzájomná výmena plazmidov (vrátane iných druhov). Percento konjugovaných (úspešne dodaných) baktérií v celkovej bakteriálnej populácii je rozhodujúce pre účinnosť resenzibilizácie. Tento proces je riadený niekoľkými komplikovanými cestami.

Baktérie majú tiež zabudované anti-CRISPR systémy, ktoré dokážu opraviť akékoľvek škody spôsobené systémami CRISPR-Cas. Obranné systémy, ktoré baktéria používa na ochranu pred cudzou DNA, sa často nachádzajú v rámci obranných ostrovov (segmenty genómu, ktoré obsahujú gény s podobnými funkciami pri ochrane hostiteľa pred útočníkmi) v bakteriálnom genóme; Napríklad:akr(gén, ktorý spolu s ďalšími podobnými variantmi funguje ako represor plazmidových konjugačných systémov) často tvoria zhluky s antagonistami iných obranných funkcií hostiteľa (napr. antireštrikčné modifikačné systémy) a odborníci sa domnievajú, že MGE (mobilné genetické elementy) organizujú svoje obranné stratégie na „antiobranných“ ostrovoch.

Stručne povedané, táto metóda sa javí ako veľmi sľubná ako alternatívny spôsob boja proti antimikrobiálnej rezistencii. Metóda je založená na koncepte resenzibilizácie baktérií na používanie už dostupných antibiotík – inými slovami, eliminácia ich rezistencie a ich opätovné zvýšenie citlivosti na antibiotiká prvej línie. Napriek tomu sú bakteriálne metabolické dráhy vždy komplikované a takéto systémy sú vždy silne regulované viacerými dráhami. Tieto regulované dráhy je potrebné podrobne preštudovať, aby sa predišlo selektívnemu tlaku, ktorý uprednostňuje aktiváciu systémov anti-CRISPR, a teda vedie k agresívnejšiemu šíreniu rezistencie.

odborný asistent Ibrahim Bitar, Mikrobiologická klinika LFUK a FN Plzeň UK v Prahe

Zdroje: