In einer aktuellen Studie, die im veröffentlicht wurde bioRxiv*Server haben Forscher im Vereinigten Königreich einen batteriebetriebenen tragbaren Luftkeimsammler evaluiert, der mithilfe eines Plaque-Assays das in einem Labor vernebelte schwere Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) mit schwerem akutem respiratorischem Syndrom wiederherstellen könnte.
*Wichtiger Hinweis: bioRxiv veröffentlicht vorläufige wissenschaftliche Berichte, die nicht von Experten begutachtet werden und daher nicht als schlüssig angesehen werden sollten, als Leitfaden für die klinische Praxis/gesundheitsbezogenes Verhalten dienen oder als etablierte Informationen behandelt werden sollten.
Hintergrund
Forscher diskutieren weiterhin über das wahrgenommene Risiko der Aerosolisierung lebensfähiger SARS-CoV-2-Ribonukleinsäure (RNA) seit ihrem Auftreten Ende 2019. Da zuverlässige Daten zur Virusisolierung fehlen, ist eine retrospektive Analyse von Superspreading-Ereignissen der einzige Weg, dies zu glauben Dieses Virus wird durch Aerosole übertragen. Beispielsweise könnte die Luft in Krankenzimmern SARS-CoV-2 vernebelt haben. Studien haben jedoch nicht die Rückgewinnung und Quantifizierung von aerosolisiertem SARS-CoV-2 mit Infektionspotenzial nachgewiesen.
Es blieb experimentell eine Herausforderung, eine zuverlässige Methode zur Erfassung von SARS-CoV-2 aus der Luft zu entwickeln. Zytopathische Tests zeigen das Vorhandensein infektiöser Viren; Ihre Ergebnisse sind jedoch subjektiv. Sie verlassen sich oft auf das Fachwissen eines Technikers, um Veränderungen in der Zellmorphologie aufgrund infizierender Viren zu erkennen. Damit sind Plaque-Assays der Goldstandard für die Quantifizierung infektiöser Viren. Die Anzahl der einzelnen Plaques in der Zellkultur gibt den Virustiter des Inokulums in Plaque-Assays an.
Über die Studie
In der vorliegenden Studie zerstäubten die Forscher zunächst SARS-CoV-2 (Delta-Variante) in einer Stammkonzentration von 1,4 x 105 Plaque-bildenden Einheiten (PFU)/ml in einer mikrobiologischen Sicherheitswerkbank der Klasse II (MBSC) unter Verwendung eines Blaustein-Atomisierungsmoduls ( BLAM) Zerstäuber.
Für jede Studienbedingung erzeugten sie vier Minuten lang Aerosole mit einer Geschwindigkeit von 18 Litern pro Minute (l/min). Ein MD8-Flughafen mit Gelatinemembranen gewann SARS-CoV-2-RNA mit einer Rate von 30 l/Minute (insgesamt 50 Liter). Die Methode beruhte auf der mechanischen Bewegung der Membran und der Zugabe von Chemikalien.
Das Team testete während der Entwicklung des Studienprotokolls zahlreiche Variablen. Außerdem führten sie für jede getestete Variable drei biologische Replikate durch. Insgesamt führten sie dieses Experiment in drei Phasen durch.
In Phase I ermittelte das Team, ob das Experiment vor der Plaquierung eine Passage in Zellen (Anreicherungsschritt) erforderte. Darüber hinaus ermittelten sie den optimalen Zeitpunkt zum Auflösen von Gelatinemembranen. Die optimale Zeit zum Auflösen von Gelatinemembranen lag zwischen einer Stunde, vier Stunden und 24 Stunden. Schließlich untersuchten sie für jede Probe die temporären Lagerungsbedingungen gelöster Membranen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM). Sie ist die primäre Studienvariable, die die Viskosität der suspendierten Gelatinemembranen bestimmt, was wiederum die genaue Pipettierung der Suspension beeinflusst. Die Lagerbedingungen reichten von Raumtemperatur (RT) bis 4 °C und –20 °C.
In Phase II testete das Team die DMEM-Mengen (5 ml, 10 ml oder 20 ml), die zum Aufhängen der Gelatinemembran nach dem Einfangen des Aerosols erforderlich sind. Sie berücksichtigten auch das Probenvolumen, das zur Infektion von Zellen erforderlich ist (100 µL oder 200 µL). In Phase III maß das Team die Auswirkungen des Einfrierens von Gelatinemembranen kurz nach der Viruswiederherstellung. Es half ihnen dabei, die Probenverarbeitung als bequem für das Laborpersonal einzuschätzen.
Studienergebnisse
Eine einzige Passage in Zellen steigerte die SARS-CoV-2-Wiederherstellung durch die Studienmethode, obwohl das Einfrieren von Membranen vor der Suspendierung in Kulturmedien die Wiederfindung verringerte. Basierend auf den Studiendaten empfehlen die Autoren, dass die Proben unmittelbar nach der Entnahme verarbeitet werden. Leider schränkte die Anforderung der Zellpassage die direkte Quantifizierung der Virustiter ein, die ursprünglich bei der Luftprobenahme ermittelt wurden. Obwohl in kleinen Mengen, konnte die Untersuchungsmethode SARS-CoV-2 durch Zellpassage vor dem Plaque-Assay zurückgewinnen.
Schlussfolgerungen
Die Autoren konnten nicht klären, ob die Studienmethode für jede besorgniserregende SARS-CoV-2-Variante (VOC) separat optimiert werden musste. Daher empfahlen sie, alle Zelltechniken auf neuartige VOCs zu evaluieren, um einen Rahmen für die Optimierung zu schaffen.
Die im Labor erzeugten Aerosole können nicht alle Partikelgrößen in aus menschlicher Sprache stammenden Aerosolen reproduzieren. Darüber hinaus konnte das in der Studie verwendete BLAM auch nicht die Zusammensetzung viraler Aerosole reproduzieren, die durch menschliche Ausatmung erzeugt werden. Außerdem variieren die vom Menschen erzeugten Aerosole je nach Schwere der Erkrankung von Person zu Person. Dennoch könnten die aktuellen Studienergebnisse bei der weiteren Erforschung der SARS-CoV-2-Übertragung hilfreich sein und zur Entwicklung von Probenahmemethoden in der Umwelt beitragen.
*Wichtiger Hinweis: bioRxiv veröffentlicht vorläufige wissenschaftliche Berichte, die nicht von Experten begutachtet werden und daher nicht als schlüssig angesehen werden sollten, als Leitfaden für die klinische Praxis/gesundheitsbezogenes Verhalten dienen oder als etablierte Informationen behandelt werden sollten.
Referenz:
- Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
Eine optimierte Methode zur Rückgewinnung und Quantifizierung von im Labor erzeugten SARS-CoV-2-Aerosolen durch Plaque-Assay, Rachel L. Byrne, Susan Gould, Thomas Edwards, Dominic Wooding, Barry Atkinson, Ginny Moore, Kieran Collings, Cedric Boisdon, Simon Maher, Giancarlo Biagini , Emily R. Adams, Tom Fletcher, Shaun H. Pennington, bioRxiv-Vorabdruck 2022, DOI: https://doi.org/10.1101/2022.10.31.514483, https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.10.31.514483v1
