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Ein tragbarer Luftprobennehmer zur Quantifizierung und Erfassung von SARS-CoV-2-Aerosolen in Labors

In einer kürzlich veröffentlichten Studie bioRxiv* Server werteten Forscher im Vereinigten Königreich einen batteriebetriebenen tragbaren Luftkeimsammler aus, der Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) mit schwerem akutem Atemwegssyndrom, das in einem Labor mit einem Plaque-Assay vernebelt wurde, zurückgewinnen konnte.

Studie: Eine optimierte Methode zur Rückgewinnung und Quantifizierung von im Labor generierten SARS-CoV-2-Aerosolen durch Plaque-Assay. Bildnachweis: ktsdesign / ShutterstockLernen: Eine optimierte Methode zur Rückgewinnung und Quantifizierung von im Labor generierten SARS-CoV-2-Aerosolen durch Plaque-Assay. Bildnachweis: ktsdesign / Shutterstock

Hintergrund

Forscher diskutieren weiterhin das wahrgenommene Risiko der Aerosolisierung von lebensfähiger SARS-CoV-2-Ribonukleinsäure (RNA) seit ihrem Auftreten Ende 2019. In Ermangelung zuverlässiger Daten zur Virusisolierung ist die retrospektive Analyse von Superspreading-Ereignissen die einzige Möglichkeit, dies zu glauben Dieses Virus wird durch Aerosole übertragen. Beispielsweise könnte die Luft in Krankenhauszimmern SARS-CoV-2 vernebelt haben. Studien haben jedoch nicht die Wiederfindung und Quantifizierung von aerosolisiertem SARS-CoV-2 mit Infektionspotenzial gezeigt.

Es blieb eine experimentelle Herausforderung, eine zuverlässige Methode zum Einfangen von SARS-CoV-2 aus der Luft zu entwickeln. Zytopathische Assays zeigen das Vorhandensein infektiöser Viren; Ihre Ergebnisse sind jedoch subjektiv. Sie verlassen sich oft auf das Fachwissen eines Technikers, um Veränderungen in der Zellmorphologie aufgrund von infizierenden Viren zu erkennen. Es macht Plaque-Assays zum Goldstandard für die Quantifizierung infektiöser Viren. Die Anzahl diskreter Plaques in der Zellkultur zeigt den viralen Titer des Inokulums in Plaque-Assays an.

Über das Studium

In der vorliegenden Studie vernebelten die Forscher SARS-CoV-2 (Delta-Variante) zunächst in einer Stammkonzentration von 1,4 x 105 Plaque-bildenden Einheiten (PFU)/ml innerhalb einer mikrobiologischen Sicherheitswerkbank (MBSC) der Klasse II unter Verwendung eines Blaustein-Zerstäubungsmoduls ( BLAM) Zerstäuber.

Für jede Studienbedingung erzeugten sie vier Minuten lang Aerosole mit einer Geschwindigkeit von 18 Litern pro Minute (l/min). Ein MD8 Airport mit Gelatinemembranen hat SARS-CoV-2-RNA mit einer Rate von 30 l/Minute (insgesamt 50 Liter) gewonnen. Das Verfahren beruhte auf mechanischer Bewegung der Membran und der Zugabe von Chemikalien.

Während der Entwicklung des Studienprotokolls testete das Team zahlreiche Variablen. Außerdem führten sie drei biologische Wiederholungen für jede getestete Variable durch. Insgesamt führten sie dieses Experiment in drei Phasen durch.

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In Phase I stellte das Team fest, ob das Experiment vor dem Plaque eine Passage in Zellen (Anreicherungsschritt) erforderte. Außerdem ermittelten sie den optimalen Zeitpunkt zum Auflösen von Gelatinemembranen. Die optimale Zeit zum Auflösen von Gelatinemembranen lag im Bereich zwischen einer Stunde, vier Stunden und 24 Stunden. Schließlich untersuchten sie für jede Probe die temporären Lagerbedingungen von gelösten Membranen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM). Es ist die primäre Studienvariable, die die Viskosität der suspendierten Gelatinemembranen bestimmt, die wiederum das genaue Pipettieren der Suspension beeinflusst. Die Lagerbedingungen reichten von Raumtemperatur (RT) bis 4 oC und –20 oC.

In Phase II testete das Team die DMEM-Mengen (5 ml, 10 ml oder 20 ml), die zum Suspendieren der Gelatinemembran nach dem Einfangen des Aerosols benötigt werden. Sie berücksichtigten auch das zum Infizieren von Zellen erforderliche Probenvolumen (100 µl oder 200 µl). In Phase III maß das Team die Auswirkungen des Einfrierens von Gelatinemembranen kurz nach der Erholung des Virus. Es half ihnen, die Probenverarbeitung als bequem für das Laborpersonal einzuschätzen.

Studienergebnisse

Eine einzelne Passage in Zellen verbesserte die Erholung von SARS-CoV-2 durch die Studienmethode, obwohl das Einfrieren von Membranen vor dem Suspendieren in Kulturmedien die Erholung verringerte. Basierend auf den Studiendaten werden die von den Autoren empfohlenen Proben unmittelbar nach der Entnahme verarbeitet. Unglücklicherweise schränkte das Erfordernis der Zellpassage die direkte Quantifizierung von viralen Titern ein, die ursprünglich während der Luftprobenahme gewonnen wurden. Obwohl es sich um ein kleines Volumen handelt, könnte die Studienmethode SARS-CoV-2 durch Zellpassage vor dem Plaque-Assay gewinnen.

Schlussfolgerungen

Die Autoren konnten nicht klären, ob die Studienmethode für jede bedenkliche SARS-CoV-2-Variante (VOC) separat optimiert werden musste. Daher empfahlen sie, alle Zelltechniken für neuartige VOCs zu evaluieren, um einen Rahmen für die Optimierung zu schaffen.

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Die im Labor erzeugten Aerosole können nicht alle Partikelgrößen in aus menschlicher Sprache stammenden Aerosolen replizieren. Darüber hinaus konnte das in der Studie verwendete BLAM auch die Zusammensetzung viraler Aerosole, die durch menschliche Ausatmung erzeugt werden, nicht replizieren. Auch die vom Menschen erzeugten Aerosole variieren zwischen Individuen je nach Schweregrad der Erkrankung. Dennoch könnten die aktuellen Studienergebnisse die weitere Erforschung der Übertragung von SARS-CoV-2 unterstützen und zur Entwicklung von Probenahmemethoden in der Umwelt beitragen.

*Wichtiger Hinweis

bioRxiv veröffentlicht vorläufige wissenschaftliche Berichte, die nicht von Fachleuten begutachtet wurden und daher nicht als abschließend angesehen werden sollten, die klinische Praxis/das gesundheitsbezogene Verhalten leiten oder als etablierte Informationen behandelt werden sollten.

Referenz:

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