In einer kürzlich veröffentlichten Studie bioRxiv* haben Forscher in den Vereinigten Staaten gezeigt, dass die Hauptprotease (Mpro) von Coronaviren (CoVs) Inflammasom-Antworten des Wirts aktiviert.
Effektor-getriggerte Immunität (ETI) ist eine Abwehrstrategie von Wirten, bei der angeborene Sensoren Krankheitserreger erkennen und eine Untergruppe von ETI-Sensoren in Eukaryoten Inflammasome bildet. Inflammasomen sind große Immunkomplexe in Zellen, die entzündungsfördernde Caspasen, hauptsächlich Caspase 1 (CASP1), aktivieren, um Entzündungssignale und den pyroptotischen Zelltod auszulösen.
Beim Menschen erkennen Inflammasom-bildende Sensoren wie Caspase Recruitment Domain Family Member 8 (CARD8) die Aktivität viraler Proteasen. CARD8 enthält einen ungeordneten N-Terminus und eine C-terminale Function-to-Find-Domäne (FIIND) und CARD. Die Selbstspaltung von FIIND führt zu einem zweiteiligen Sensor, bei dem der N-Terminus als Stolperdraht für virale Proteasen fungiert.
Die Studie und Ergebnisse
In der vorliegenden Studie bewerteten die Forscher die Wahrnehmung viraler Proteasen durch das CARD8-Inflammasom. Unter Verwendung eines zuvor beschriebenen bioinformatischen Ansatzes erstellten die Autoren ein Vorhersagemodell für den Mpro [also known as 3-chymotrypsin-like protease (3CLpro)] von CoVs. Sie identifizierten zwei mutmaßliche Mpro-Spaltstellen im N-Terminus von humanem CARD8. Die CARD8-Isoform wurde mit Mpro des schweren akuten respiratorischen Syndroms (SARS)-CoV-2 koexprimiert.
Ein 34-kDa-CARD8-Produkt wurde in Gegenwart von SARS-CoV-2 Mpro nachgewiesen, das voraussichtlich aus der Spaltung bei Q37 resultiert. Die Spaltstelle wurde durch Mutieren des Rests an der Stelle (zu Q37A) bestätigt, wodurch das 34 kDa-Produkt nach der Mpro-Behandlung eliminiert wurde. Interessanterweise erzeugte die Q37A-Mutante ein kryptisches Mpro-abhängiges 37-kDa-Produkt, das aus der Spaltung bei Q61 resultierte. Darüber hinaus war die Q37A-Q61A-Mutante von CARD8 unempfindlich gegenüber einer Spaltung durch SARS-CoV-2 Mpro.
Die Transfektion von HEK293T-Zellen mit CASP1, Pro-Interleukin-1-beta (Pro-IL-1β) und Mpro führte zu einer robusten Prozessierung von Pro-IL-1β zu aktivem IL-1. In CARD8-knocked-out (KO)-Zellen trat keine Inflammasom-Aktivierung auf. Weiterhin wurden CARD8-KO-Zellen mit Wildtyp-CARD8 oder Spaltstellenmutanten komplementiert. Die Wildtyp-CARD8-Komplementierung rettete die Mpro-induzierte Inflammasom-Aktivierung. Im Gegensatz dazu war die Mpro-induzierte Inflammasom-Aktivierung in den CARD8-KO-Zellen reduziert (mit Q37A-Mutante) oder aufgehoben (mit Q37A-Q61A-Mutante).
Zusätzlich testeten sie, ob auch Proteasen anderer relevanter CoVs CARD8 spalten. Zu diesem Zweck klonten sie Mpros von anderen CoVs wie humanem CoV (HCoV)-229E, HCoV-NL63, HCoV-HKU1, SARS-CoV, Middle-East Respiratory Syndrome (MERS)-CoV und murinem Hepatitis-Virus (MHV). . Alle getesteten Proteasen spalteten und aktivierten CARD8 ortsspezifisch. Darüber hinaus wurde die THP-1-Zelllinie mit HCoV-229E infiziert, um die Folgen der CARD8-Inflammasom-Aktivierung zu bewerten.
Die HCoV-229E-Infektion führte signifikant zur Freisetzung von IL-1β und zum Zelltod von Wildtyp-Zellen, aber nicht von CARD8-KO-Zellen. Die Wildtyp- oder CARD8-KO-THP-1-Zelllinie wurde so verändert, dass sie das Angiotensin-Converting-Enzym 2 (ACE2) und die Transmembranprotease Serin 2 (TMPRSS2) exprimiert und mit SARS-CoV-2 infiziert wurde. Zelltod und IL-1β-Freisetzung waren in ACE2- und TMPRSS2-exprimierenden Wildtypzellen offensichtlich, aber nicht in KO-Zellen.
Als nächstes untersuchte das Forschungsteam, ob das CARD8-Inflammasom als Mpro-Sensor in Rousettus aegyptiacus (einer Megabat-Art) diente. Dem Megabat CARD8 fehlen Q37 und Q61 und er wurde vom Mpro von SARS-CoV-2 nicht gespalten. Eine TEVpro-Spaltstelle wurde in den N-Terminus von Megabat CARD8 eingefügt, um zu bestimmen, ob ein funktioneller Abbau ihn aktivieren könnte. Die TEVpro-Spaltung des manipulierten CARD8 führte zur Aktivierung des Inflammasoms. Weitere Untersuchungen ergaben, dass SARS-CoV-2 Mpro nicht aktiviert wurde und stattdessen die TEVpro-vermittelte Aktivierung der Fledermaus CARD8 antagonisierte. In ähnlicher Weise verhinderten alle anderen Mpros die TEVpro-vermittelte Aktivierung des Fledermaus-CARD8-Inflammasoms.
Die Forscher analysierten nicht-synonyme Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) in CARD8 innerhalb der menschlichen Bevölkerung. Sie fanden mehrere hochfrequente SNPs, darunter eine S39P-Variante, die sich an der P2′-Position innerhalb der proteolytischen Spaltstelle befindet, die in mehr als 20 % der afrikanischen und afroamerikanischen Proben vorhanden war. Die Variante CARD8 P39 zeigte eine reduzierte Empfindlichkeit gegenüber Spaltung und Aktivierung durch CoV Mpros.
Schließlich untersuchte das Team, ob die Variante CARD8 P39 die Erkennung anderer Krankheitserreger beeinflusst. Das P2′-Prolin in der Spaltstelle wurde für das Vorhersagemodell der Enterovirus-3C-Protease (3Cpro) bevorzugt. Spalttests mit 3Cpro aus dem humanen Rhinovirus (HRV), einem Picornavirus, zeigten, dass die CARD8-Spaltung bei Q37 für die P39-Variante ausgeprägter war. Darüber hinaus fehlte die Inflammasom-Aktivierung durch HRV 3Cpro in HEK293T CARD8 KO-Zellen, die mit CARD8 S39 ergänzt wurden, aber robust, wenn sie mit CARD8 P39 ergänzt wurden. Das Team beobachtete auch, dass Variationen in CARD8 die Spaltung durch 3Cpros von anderen Picornaviren beeinflussten.
Schlussfolgerungen
Insgesamt zeigte die Studie, dass CARD8 ein polymorpher, sich schnell entwickelnder angeborener Immunsensor für Infektionen durch Positiv-Sense-RNA-Viren ist. Dass die SARS-CoV-2-Infektion die CARD8-Inflammasom-Aktivierung in THP-1-Zellen verursacht, unterstreicht die Rolle der Inflammasomen bei der schweren Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19), was darauf hindeutet, dass das CARD8-Inflammasom in Makrophagen/Monozyten zur Entzündung bei COVID-19-Patienten beiträgt.
*Wichtiger Hinweis
bioRxiv veröffentlicht vorläufige wissenschaftliche Berichte, die nicht von Fachleuten begutachtet wurden und daher nicht als abschließend angesehen werden sollten, die klinische Praxis/das gesundheitsbezogene Verhalten leiten oder als etablierte Informationen behandelt werden sollten.
Referenz:
- Tsu BV, Agarwal R., Gokhale NS, et al. Wirtsspezifische Erkennung von Coronaviren und Picornaviren durch das CARD8-Inflammasom. bioRxiv, 2022. DOI: 10.1101/2022.09.21.508960, https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.09.21.508960v1
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