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Forscher erforschen den Eintrittsweg von SARS-CoV-2 und nachgelagerte zelluläre und virale Prozesse

In einer kürzlich veröffentlichten Studie bioRxiv* Preprint-Server bewerteten die Forscher die Auswirkungen des Eintrittswegs des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) auf nachgelagerte zelluläre und virale Prozesse.

Studie: Der Eintrittsweg von SARS-CoV-2 beeinflusst eine Reihe nachgelagerter viraler und zellulärer Prozesse. Bildnachweis: PHOTOCREO Michal Bednarek/Shutterstock
Lernen: Der Eintrittsweg von SARS-CoV-2 beeinflusst eine Reihe nachgeschalteter viraler und zellulärer Prozesse. Bildnachweis: PHOTOCREO Michal Bednarek/Shutterstock

Hintergrund

Trotz der Variation der SARS-CoV-2-Spike (S)-Proteine ​​zwischen den Varianten ist der Eintrittsschritt im Lebenszyklus von SARS-CoV-2 entscheidend. Die SARS-CoV-2-Infektion von Wirtszellen beginnt mit der Zellanheftung über C-Typ-Lektinrezeptoren. Das Virus bindet an die Zellmembranen und das S-Protein bindet direkt an den primären Rezeptor namens Angiotensin-Converting-Enzym 2 (ACE2).

Die Spaltung des S-Proteins legt das Fusionspeptid frei, das die Fusion von Wirt-Virus-Membranen erleichtert und so eine Pore erzeugt, die die Virusfreisetzung in die Wirtszellen ermöglicht. Diese S-Spaltung findet in Gegenwart von humaner Transmembranprotease Serin 2 (TMPRSS2) statt. Daher beeinflussten die Expressionsniveaus von TMPRSS2 den Mechanismus, den das Virus zum Eindringen in ACE2-exprimierende Zellen verwendet.

Über das Studium

In der vorliegenden Studie untersuchten die Forscher die Assoziation des SARS-CoV-2-Eintrittswegs mit physiologisch relevanten nachgeschalteten Virus- und Wirtsprozessen.

Das Team entwickelte lentivirale Transgen-Transportplasmide, die entweder murine oder humane ACE2-Proteine ​​kodierten, zusammen mit lentiviralen Transgen-Transportplasmiden, die entweder eine katalytisch inaktive Version (ΔHDS) oder ein funktionelles TMPRSS2-Protein kodierten. Plasmide wurden verwendet, um eine Reihe von Zelllinien zu entwickeln, die ektopisch exprimierten, während die Western-Blot-Analyse die murine oder menschliche ACE2-Expression in A549-A-, A549-AT(ΔHDS), A549-AT- und A549-mAT-Zellen bestimmte.

Darüber hinaus wurde die Infektionsanfälligkeit der gentechnisch veränderten oder parentalen Zelllinien unter Verwendung des Ancestral-Virus (B.1) und der SARS-CoV-2-Varianten B.1.617 und B.1.1.529 (VOCs) bewertet.

Die Anfälligkeit des Virus für eine Eintrittshemmung in die Lungenepithelzellen wurde durch authentische Virusinfektionen bewertet, die einem TMPRSS2-Inhibitor namens Camostatmesylat und einem Cathepsin-B/L-Inhibitor namens E-64d ausgesetzt wurden.

Darüber hinaus bewertete das Team, ob der Oberflächeneintritt an der Plasmamembran in TMPRSS2-defizienten Zellen künstlich stimuliert werden könnte, indem Infektionen unter angesäuerten Bedingungen durchgeführt werden.

Ergebnisse

Die Studienergebnisse zeigten, dass die Expression und Autospaltung von TMPRSS2 zu zwei Fragmenten in A549-T- und A549-AT-Zellen führte. Das Team beobachtete angesammeltes TMPRSS2 in voller Länge in den A549-AT(ΔHDS)-Zellen, die keine Serinproteaseaktivität und Autospaltung aufwiesen. Dies bestätigte keine endogene Expression von TMPRSS2 oder ACE2 in den parentalen A549-Zellen.

Darüber hinaus war die B.1-Replikation in A549-AT-Zellen mit einem mäßigen Anstieg der VOCs signifikant erhöht. Die Verstärkung in allen drei Virusstämmen ging auf Werte zurück, die ähnlich oder niedriger waren als die, die in A549-A-Zellen in Gegenwart von inaktivem TMPRSS2 gefunden wurden. Bemerkenswerterweise war die Akkumulation der B.1.1.529-Nucleocapsid-Proteine ​​in den TMPRSS2-Zellen vergleichbar, die entweder murines oder humanes ACE2 überexprimierten.

Die Akkumulation war jedoch für B.1- und B.1.617-Varianten nicht ähnlich, was auf einen ausgedehnten Bereich von Wirten hinwies, die murines ACE2 für B.1.1.529 verwendeten. Darüber hinaus waren die intrazelluläre Transkription und Replikation von B.1 und B.1.1.529 in A549-AT-Zellen deutlich erhöht im Vergleich zu den A549-AT(ΔHDS)-Zellen, die für die B.1.617-Variante nicht gefunden wurden.

Das Team stellte auch fest, dass die Virionsekretionsraten in den A549-AT-Zellen für B.1 erheblich erhöht waren, in A549-AT für B.1.617 moderat erhöht und in Überständen von leicht erhöht in A549-AT für B.1.617 nicht wahrnehmbar und nicht nachweisbar waren 210 in Überständen von A549-A und A549-AT für B.1.1.529. Andererseits gab es einen signifikanten B.1.1.529-Austritt in den Vero-E6-Zellen auf niedrigeren Niveaus als in den B.1- und B.1.617-Varianten. Dies zeigte signifikante Unterschiede zwischen dem Tropismus der Lungenepithelzellen und der TMPRSS2-Abhängigkeit zwischen verschiedenen SARS-CoV-2-Stämmen.

Darüber hinaus hemmte Camostatmesylat die B.1-Infektion bei A549-AT-Zellen, aber nicht bei A549-A-Zellen. Bemerkenswerterweise wurde die B.1.617-Infektion für keinen der Zelltypen gehemmt. E-64d hemmte jedoch die B.1.617- und B.1-Infektion beider Zelltypen bemerkenswert.

Die B.1-Infektion unter den A549-AT(ΔHDS)-Zellen nahm im Vergleich zu A549-A-Zellen unter allen Bedingungen weiter ab, was darauf hinwies, dass funktionell inaktives TMPRSS2 die Bindung von ACE2 durch sterische Hinderung blockierte. Dieses Phänomen wurde für die B.1.617-Variante nicht gefunden, was die potenziellen Unterschiede in der Bindung von ACE2 zwischen den Stämmen hervorhob.

Die Leseabdeckung und die durchschnittliche Sequenzierungstiefe über virale Genome hoben die Variationen bei den frühen Transkriptionsraten und der viralen Replikation hervor, die zwischen den A549-AT- und A549-A-Zellen gefunden wurden. Dies zeigte auch hochgradig konservierte Transkriptprofile über das genomische Profil von SARS-CoV-2, was die Konservierung der Expression des offenen Leserahmens (ORF) sowie der Genomreplikationskinetik zwischen VOC und Vorfahrenstämmen bestätigte. Insgesamt zeigten die Daten, dass die TMPRSS2-Expression die Infektionsraten der SARS-CoV-2-Stämme B.1, B.1.617 und B.1.1.529 verbesserte.

Insgesamt hoben die Studienergebnisse die Unterschiede zwischen den SARS-CoV-2-Stämmen B.1, B.1.617 und B.1.1.529 in Bezug auf die TMPRSS2-Abhängigkeit und ihre Korrelation mit der nachgelagerten Aktivierung von Immunantworten nach dem Viruseintritt hervor.

*Wichtiger Hinweis

bioRxiv veröffentlicht vorläufige wissenschaftliche Berichte, die nicht von Fachleuten begutachtet wurden und daher nicht als schlüssig angesehen werden sollten, die klinische Praxis/das gesundheitsbezogene Verhalten leiten oder als etablierte Informationen behandelt werden sollten.

Referenz:

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