يتيح اختراق معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا وضع العلامات السريعة والمتسقة للبروتين في الأنسجة ثلاثية الأبعاد

يتيح اختراق معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا وضع العلامات السريعة والمتسقة للبروتين في الأنسجة ثلاثية الأبعاد

تسمح تقنية جديدة تم تطويرها في معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا للعلماء بتسمية البروتينات في ملايين الخلايا الفردية في أنسجة ثلاثية الأبعاد سليمة تمامًا بسرعة وتوحيد وتنوع غير مسبوق. أتاحت هذه التقنية للفريق تصنيف كميات وفيرة من عينات الدماغ الكاملة وعينات الأنسجة الكبيرة الأخرى في يوم واحد. في دراستهم الجديدة فيالتكنولوجيا الحيوية الطبيعية,كما أظهروا أيضًا أن القدرة على تصنيف البروتينات باستخدام الأجسام المضادة على مستوى الخلية الواحدة عبر أدمغة بأكملها يمكن أن تكشف عن رؤى مخفية بواسطة طرق وضع العلامات الأخرى المستخدمة على نطاق واسع.

يعد تحديد البروتينات التي تصنعها الخلايا عنصرًا أساسيًا في الدراسات في علم الأحياء وعلم الأعصاب والمجالات أو العلاج ذات الصلة. بقدر ما تقدمت تقنيات الفحص المجهري ووضع العلامات، مما أتاح اكتشافات لا تعد ولا تحصى. لا يزال العلماء يفتقرون إلى طريقة موثوقة وعملية لتتبع التعبير البروتيني على مستوى ملايين الخلايا الفردية المكتظة بكثافة في أنسجة سليمة ثلاثية الأبعاد تمامًا، مثل دماغ الفأر بأكمله أو منطقة كاملة من الدماغ البشري. غالبًا ما كان العلماء يقتصرون على أقسام الأنسجة الرقيقة الموجودة أسفل الرقائق، وبالتالي كانوا يفتقرون إلى الأدوات اللازمة لتقدير تعبير البروتين الخلوي بدقة في الأنظمة المترابطة بأكملها التي يحدث فيها.

تقليديا، تتطلب دراسة الجزيئات في الخلايا تفكيك الأنسجة إلى خلايا مفردة أو تقطيعها إلى أقسام رقيقة لأن الضوء والمواد الكيميائية اللازمة للتحليل لا يمكنها اختراق الأنسجة بعمق. قام مختبرنا بتطوير تقنيات مثل Clarity وShield التي تمكن من دراسة الأعضاء بأكملها من خلال جعلها شفافة. نحن الآن بحاجة إلى طريقة لتصنيف الأعضاء بأكملها كيميائيًا لاكتساب المعرفة العلمية المفيدة. تخيل تتبيل شريحة لحم سميكة بمجرد غمسها في الصلصة. تمتص الطبقات الخارجية التتبيلة بسرعة وبشكل مكثف، بينما تظل الطبقات الداخلية دون مساس إلى حد كبير ما لم يتم نقع اللحم لفترة طويلة من الزمن. وينطبق المبدأ نفسه على المعالجة الكيميائية للأنسجة: إذا لم تتم معالجة الخلايا الموجودة داخل الأنسجة بشكل موحد، فلا يمكن مقارنتها كميًا. إن التحدي أكبر بالنسبة لوضع العلامات على البروتين لأن المواد الكيميائية التي نستخدمها لوضع العلامات أكبر بمئات المرات من تلك الموجودة في المخللات. ونتيجة لذلك، يمكن أن تستغرق هذه الجزيئات أسابيع لتنتشر في الأعضاء السليمة، مما يجعل المعالجة الكيميائية المتسقة لأنسجة الأعضاء مستحيلة تقريبًا وبطيئة للغاية. "

كوانغهون تشونغ، مؤلف رئيسي وأستاذ مشارك في معهد بيكاور للتعلم والذاكرة، وأقسام الهندسة الكيميائية وعلوم الدماغ والإدراك، ومعهد الهندسة الطبية والعلوم في معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا

يمثل النهج الجديد، المسمى "المنحنى"، خطوة مهمة إلى الأمام في تحقيق هذا الهدف من خلال إظهار نهج جديد بشكل أساسي لمعالجة الأنسجة الكبيرة والكثيفة بشكل متساوٍ. في الدراسة، يشرح الباحثون كيف تغلبوا على العقبات التقنية من خلال تطبيق منحنى يسمى "Eflash" وقدموا عروضًا حية وافرة للتكنولوجيا، بما في ذلك رؤى من نتائج علم الأعصاب الجديدة.

وقال داي هي يون، المؤلف الرئيسي المشارك، وهو طالب دراسات عليا سابق في معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا ويعمل الآن مهندس تطبيقات أول في شركة LifeCanvas Technologies، وهي شركة ناشئة يعمل تشونغ على نشرها لنشر الأدوات التي يخترعها مختبره: "إن هذه قفزة كبيرة، خاصة فيما يتعلق بالأداء الفعلي للتكنولوجيا". المؤلف الرئيسي الآخر لهذه الورقة هو يونج جيون بارك، وهو باحث سابق في مرحلة ما بعد الدكتوراه في معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا ويعمل الآن أستاذًا مساعدًا في جامعة كايست في كوريا الجنوبية.

الكيمياء الذكية

السبب الأساسي وراء صعوبة تصنيف عينات الأنسجة ثلاثية الأبعاد الكبيرة بشكل موحد هو أن الأجسام المضادة تخترق الأنسجة ببطء شديد ولكنها ترتبط بسرعة بالبروتينات المستهدفة. التأثير العملي لعدم تطابق السرعة هذا هو أن مجرد نقع الدماغ في حمام من الأجسام المضادة يعني أن البروتينات الموجودة على الحافة الخارجية للنسيج يتم تصنيفها بشكل مكثف، ولكن عمليًا لا تجد أي من الأجسام المضادة خلايا وبروتينات أعمق في الداخل.

ولتحسين وضع العلامات، صمم الفريق طريقة - الجوهر المفاهيمي للمنحنى - لحل مشكلة عدم تطابق السرعة. كانت الإستراتيجية هي التحكم المستمر في وتيرة ربط الأجسام المضادة مع تسريع تغلغل الأجسام المضادة في جميع أنحاء الأنسجة. لمعرفة كيفية عمل ذلك وتحسين النهج، قاموا بإنشاء وتشغيل محاكاة حسابية متطورة سمحت لهم باختبار إعدادات ومعايير مختلفة، بما في ذلك معدلات الارتباط المختلفة وكثافات الأنسجة وتركيباتها.

ثم شرعوا في تنفيذ نهجهم في الأنسجة الحقيقية. كانت نقطة البداية هي تقنية سابقة تسمى "التبديل"، حيث طور مختبر تشونغ طريقة لإيقاف ربط الأجسام المضادة مؤقتًا، والسماح للأجسام المضادة باختراق الأنسجة، ثم تشغيل الارتباط مرة أخرى. طريقة العمل، وجد الفريق أنه يمكن أن تكون هناك تحسينات كبيرة إذا كان من الممكن التحكم في معدل ربط الأجسام المضادة بشكل مستمر، ولكن المواد الكيميائية المستخدمة في التبديل كانت قاسية للغاية بحيث لا يمكن لمثل هذا العلاج المستمر. لذلك قام الفريق بفحص مكتبة من المواد الكيميائية المماثلة للعثور على مادة يمكنها أن تخفض بمهارة وبشكل مستمر معدل ربط الأجسام المضادة بشكل أكثر دقة ومستمرًا. ووجدوا أن حمض الديوكسيكوليك كان المرشح المثالي. باستخدام هذه المادة الكيميائية، تمكن الفريق من تعديل ارتباط الأجسام المضادة ليس فقط عن طريق تغيير تركيز المادة الكيميائية، ولكن أيضًا عن طريق تغيير الرقم الهيدروجيني (أو الحموضة) في حمام وضع العلامات.

لتسريع حركة الأجسام المضادة عبر الأنسجة، استخدم الفريق تقنية أخرى سابقة تم اختراعها في مختبر تشونغ: النقل الكهربائي العشوائي. تعمل هذه التقنية على تسريع انتشار الأجسام المضادة عبر الأنسجة عن طريق تطبيق المجالات الكهربائية.

أدى تنفيذ نظام Eflash للتشتت المتسارع هذا مع سرعة ربط قابلة للتعديل باستمرار إلى مجموعة متنوعة من النجاحات في وضع العلامات التي تم توضيحها في العمل. في المجمل، أبلغ الفريق عن استخدام أكثر من 60 جسمًا مضادًا مختلفًا لتسمية البروتينات في الخلايا عبر أدمغة الفئران والجرذان بأكملها. أجنة فأر كاملة؛ أعضاء الفأر الكاملة الأخرى، بما في ذلك الرئتين والقلب؛ وكتل من أنسجة المخ من الحيوانات الكبيرة، بما في ذلك البشر.

وقال المؤلفون إنه من الجدير بالذكر أنه تم تحديد كل من هذه العينات خلال يوم واحد، وهي سرعة "فائقة السرعة" للأعضاء الكاملة والسليمة. وبالإضافة إلى ذلك، لم تتطلب الاستعدادات المختلفة أي خطوات تحسين جديدة.

تصورات قيمة

كانت إحدى الطرق التي قام بها الفريق باختبار Eflash هي مقارنة تصنيفه بطريقة أخرى شائعة الاستخدام: وهي هندسة الخلايا وراثيًا لتتألق عندما يتم نسخ جين البروتين محل الاهتمام. لا تتطلب الطريقة الجينية نشر الأجسام المضادة في جميع أنحاء الأنسجة، ولكنها قد تكون عرضة للتناقضات لأن الإبلاغ عن نسخ الجينات وإنتاج البروتين الفعلي ليسا متماثلين تمامًا. وأضاف يون أنه في حين أن وضع العلامات على الأجسام المضادة يشير بشكل موثوق وفوري إلى وجود البروتين المستهدف، فإن الطريقة الجينية يمكن أن تكون أقل فورية واستمرارية، حيث تتألق حتى عندما لا يكون البروتين الفعلي موجودًا.

في الدراسة، استخدم الفريق كلا النوعين من العلامات في وقت واحد في العينات. عندما تصوروا الملصقات بهذه الطريقة، رأوا العديد من الأمثلة حيث كانت تسمية الجسم المضاد والملصق الجيني مختلفين تمامًا. وفي بعض مناطق أدمغة الفئران، وجدوا أن ثلثي الخلايا العصبية التي تعبر عن PV (بروتين ملحوظ في بعض الخلايا العصبية المثبطة) بعد وضع علامات على الأجسام المضادة، لم تظهر مضانًا وراثيًا. في مثال آخر، فقط جزء صغير من الخلايا التي أبلغت عن التعبير عبر الطريقة الجينية لبروتين يسمى Chat أبلغت أيضًا عن ذلك عبر ملصق الجسم المضاد. بمعنى آخر، كانت هناك حالات تم فيها مقارنة العلامات الجينية بوسم الأجسام المضادة، حيث لم يتم الإبلاغ عن التعبير البروتيني بشكل كبير أو تمت مراجعته.

لا يريد الباحثون الخوض في القيمة الواضحة لاستخدام طرق الإبلاغ الجيني، لكنهم يقترحون بدلاً من ذلك أن استخدام وسم الأجسام المضادة على مستوى العضو، كما يسمح Eflash، يمكن أن يساعد أيضًا في وضع هذه البيانات في سياق أكثر ثراءً واكتمالًا. نظرًا لأنها شاهدت حالات الإفراط في الإبلاغ عن التعبير الكهروضوئي في الفئران (واختلاف كبير بين الفئران الفردية).

كتب المؤلفون: "إن اكتشافنا لفقدان إقليمي كبير للخلايا العصبية ذات المناعة الكهروضوئية في الفئران البالغة الأصحاء ومع التباين الفردي العالي يسلط الضوء على أهمية الأنماط الظاهرية الشاملة وغير المتحيزة".

أو كما قال يون، فإن النوعين المختلفين من التصنيف هما "أداتان مختلفتان لهذه المهمة".

بالإضافة إلى يون وبارك وتشونغ، فإن مؤلفي الورقة الآخرين هم جاي هون تشو، لي كامينتسكي، نيكولاس إيفانز، نيكولاس دينابولي، كاثرين شيه، سيو وو تشوي، ألكسندر ألبانيز، يوكسوان تيان، تشانغ هو سون، تشيانغ تشانغ، مينيونغ كيم، مينيونغ كيم، جاستن سواني، ويبستر غوان، جوهيوك بارك، غابي دروموند، هيجين. تشوي ولوزداري رويلاس وجوبينج فنغ.

يأتي تمويل الدراسة من صندوق بوروز ويلكوم، وبرنامج سيرل للعلماء، وجائزة باكارد في العلوم والهندسة، وجائزة نارساد للمحقق الشاب، ومؤسسة ماكنايت، ومؤسسة الحرية معًا، ومعهد بيكووير للتعلم والذاكرة، ومؤسسة إن سي سوفت الثقافية، والمعاهد الوطنية للصحة.

مصادر: