MIT-gennembruddet muliggør hurtig og ensartet proteinmærkning i 3D-væv

MIT-gennembruddet muliggør hurtig og ensartet proteinmærkning i 3D-væv

En ny teknologi udviklet på MIT gør det muligt for forskere at mærke proteiner i millioner af individuelle celler i fuldt intakt 3D-væv med hidtil uset hastighed, ensartethed og alsidighed. Teknologien gjorde det muligt for holdet at mærke rigelige mængder af hele hjernen og andre store vævsprøver på en enkelt dag. I deres nye undersøgelse inaturlig bioteknologi,De viser også, at evnen til at mærke proteiner med antistoffer på enkeltcelleniveau på tværs af hele hjerner kan afsløre indsigt skjult af andre udbredte mærkningsmetoder.

Profilering af de proteiner, som celler skaber, er en fast bestanddel af undersøgelser inden for biologi, neurovidenskab og relaterede områder eller behandling. Så meget som mikroskopi- og mærkningsteknologier er avanceret, hvilket muliggør utallige opdagelser. Forskere manglede stadig en pålidelig og praktisk måde at spore proteinekspression på niveau med millioner af tætpakkede individuelle celler i fuldt 3D intakt væv, såsom en hel musehjerne eller en hel region af en menneskelig hjerne. Forskere var ofte begrænset til tynde vævssektioner under folier og manglede derfor værktøjer til grundigt at estimere cellulær proteinekspression i hele de indbyrdes forbundne systemer, hvori det forekommer.

Traditionelt kræver undersøgelse af molekylerne i celler, at væv adskilles i enkelte celler eller skæres i tynde sektioner, fordi lys og kemikalier, der kræves til analyse, ikke kan trænge dybt ind i væv. Vores laboratorium udviklede teknologier som Clarity og Shield, der gør det muligt at studere hele organer ved at gøre dem gennemsigtige. Vi havde nu brug for en måde at kemisk mærke hele organer for at få brugbar videnskabelig viden. Forestil dig at marinere en tyk bøf ved blot at dyppe den i saucen. De ydre lag absorberer marinaden hurtigt og intenst, mens de inderste lag forbliver stort set uberørte, medmindre kødet lægges i blød i længere tid. Det samme princip gælder for den kemiske behandling af væv: hvis celler i et væv ikke behandles ensartet, kan de ikke sammenlignes kvantitativt. Udfordringen er endnu større for proteinmærkning, fordi de kemikalier, vi bruger til mærkning, er hundredvis af gange større end dem i marinader. Som et resultat kan disse molekyler tage uger om at diffundere ind i intakte organer, hvilket gør konsekvent kemisk behandling af organvæv praktisk talt umulig og ekstremt langsom. “

Kwanghun Chung, seniorforfatter, lektor ved Picower Institute for Learning and Memory, Department of Chemical Engineering og Brain and Cognitive Sciences og Institute of Medical Engineering and Science ved MIT

Den nye tilgang, kaldet "Kurve", repræsenterer et vigtigt skridt fremad i at nå dette mål ved at demonstrere en fundamentalt ny tilgang til jævnt at behandle store og tætte væv af helheden. I undersøgelsen forklarer forskerne, hvordan de overvandt de tekniske forhindringer gennem en implementering af kurven kaldet "Eflash" og giver rigelige livlige demonstrationer af teknologien, herunder indsigt fra nye neurovidenskabelige fund.

"Dette er et betydeligt spring, især med hensyn til teknologiens faktiske ydeevne," sagde co-lead forfatter Dae Hee Yun, en tidligere MIT kandidatstuderende og nu senior applikationsingeniør hos LifeCanvas Technologies, en startup Chung spreder for at sprede de værktøjer, hans laboratorium opfinder. Avisens anden hovedforfatter er Young-Gyun Park, en tidligere MIT postdoc-forsker, som nu er assisterende professor ved Kaist i Sydkorea.

Smart kemi

Den grundlæggende årsag til, at store 3D-vævsprøver er ensartet vanskelige at mærke, er, at antistoffer trænger ind i væv meget langsomt, men binder hurtigt til deres målproteiner. Den praktiske effekt af denne hastighedsmismatch er, at blot at gennembløde en hjerne i et bad af antistoffer betyder, at proteiner i yderkanten af ​​vævet er intenst godt mærkede, men stort set ingen af ​​antistofferne finder celler og proteiner dybere inde.

For at forbedre mærkningen designede holdet en måde - den konceptuelle essens af kurven - til at løse hastighedsmismatchet. Strategien var kontinuerligt at kontrollere tempoet for antistofbinding, mens antistofgennemtrængning gennem vævet blev accelereret. For at finde ud af, hvordan dette kunne fungere og optimere tilgangen, skabte og kørte de en sofistikeret beregningssimulering, der gjorde det muligt for dem at teste forskellige indstillinger og parametre, herunder forskellige bindingshastigheder og vævstætheder og sammensætninger.

De satte sig derefter for at implementere deres tilgang i ægte væv. Deres udgangspunkt var en tidligere teknologi kaldet "switch", hvor Chungs laboratorium udviklede en måde til midlertidigt at slå antistofbinding fra, lade antistofferne trænge ind i vævet og derefter tænde for bindingen igen. Den måde, det fungerede på, fandt holdet ud af, at der kunne være betydelige forbedringer, hvis antistofbindingshastigheden konstant kunne kontrolleres, men de kemikalier, der blev brugt i Switchen, var for hårde til en sådan løbende behandling. Så holdet undersøgte et bibliotek af lignende kemikalier for at finde en, der subtilt og kontinuerligt kunne skrue ned for en mere subtil og kontinuerlig antistofbindingshastighed. De fandt ud af, at deoxycholsyre var en ideel kandidat. Ved at bruge dette kemikalie var holdet i stand til at modulere antistofbinding ikke kun ved at variere koncentrationen af ​​kemikaliet, men også ved at variere pH (eller surhedsgrad) i mærkningsbadet.

For at fremskynde antistofbevægelsen gennem væv, brugte holdet en anden tidligere teknologi opfundet i Chung Lab: Stokastisk elektrotransport. Denne teknologi accelererer spredningen af ​​antistoffer gennem væv ved at anvende elektriske felter.

Implementering af dette accelererede spredning Eflash-system med kontinuerligt modificerbar bindingshastighed resulterede i en række mærkningssucceser, der blev demonstreret i arbejdet. I alt rapporterede holdet at bruge mere end 60 forskellige antistoffer til at mærke proteiner i celler på tværs af hele hjernen hos mus og rotter. hele museembryoner; andre hele museorganer, herunder lunger og hjerte; og blokke af hjernevæv fra større dyr, inklusive mennesker.

Navnlig blev hver af disse prøver mærket inden for en dag, en "ultrahurtig" hastighed for hele, intakte organer, sagde forfatterne. Derudover krævede forskellige forberedelser ingen nye optimeringstrin.

Værdifulde visualiseringer

En af måderne, holdet testede Eflash på, var at sammenligne dets mærkning med en anden almindeligt anvendt metode: gensplejsning af celler til at fluorescere, når genet for et protein af interesse transskriberes. Den genetiske metode kræver ikke spredning af antistoffer i hele vævet, men kan være tilbøjelig til uoverensstemmelser, fordi rapportering af gentranskription og faktisk proteinproduktion ikke er helt ens. Yun tilføjede, at selvom antistofmærkning pålideligt og øjeblikkeligt rapporterer tilstedeværelsen af ​​et målprotein, kan den genetiske metode være meget mindre øjeblikkelig og vedvarende, fluorescerende, selv når det faktiske protein ikke længere er til stede.

I undersøgelsen brugte holdet begge typer mærkning samtidigt i prøver. Når de visualiserede mærkerne på denne måde, så de mange eksempler, hvor et antistofmærke og det genetiske mærke var meget forskellige. I nogle områder af musehjerner fandt de ud af, at to tredjedele af neuroner, der udtrykker PV (et protein, der er mærkbart i visse hæmmende neuroner) efter antistofmærkning ikke viste genetisk baseret fluorescens. I et andet eksempel rapporterede kun en lille brøkdel af celler, der rapporterede ekspression via den genetiske metode af et protein kaldet Chat, det også via et antistofmærke. Med andre ord har der været tilfælde, hvor genetisk mærkning sammenlignet med antistofmærkning både i høj grad underrapporterede eller reviderede proteinekspression.

Forskerne ønsker ikke at dvæle ved den klare værdi af at bruge genetiske rapporteringsmetoder, men foreslår i stedet, at brug af organ-dækkende antistofmærkning, som Eflash tillader, også kan hjælpe med at sætte disse data ind i en rigere og mere komplet kontekst. Da hun så tilfælde af signifikant overrapportering af PV-ekspression i mus (og signifikant variation mellem individuelle mus).

"Vores opdagelse af et stort regionaliseret tab af PV-immunoreaktive neuroner i raske voksne mus og med høj individuel variabilitet fremhæver vigtigheden af ​​holistiske og uvildige fænotyper," skrev forfatterne.

Eller som Yun udtrykte det, de to forskellige typer mærkning er "to forskellige værktøjer til jobbet."

Ud over Yun, Park og Chung er avisens andre forfattere Jae Hun Cho, Lee Kamentsky, Nicholas Evans, Nicholas Dinapoli, Katherine Xie, Seo Woo Choi, Alexandre Albanese, Yuxuan Tian, ​​Chang Ho Sohn, Qiangge Zhang, Minyoung Kim, Minyoung Kim, Guan Gabi Juhy Webster, Choi, Dr. Luzdary Ruelas og Guoping Feng.

Finansiering til undersøgelsen kommer fra Burroughs Wellcome Fund, Searle Scholars Program, en Packard Award in Science and Engineering, en Narsad Young Investigator Award, McKnight Foundation, Freedom Together Foundation, Picower Institute for Learning and Memory, NCSoft Cultural Foundation og National Institutes of Health.

Kilder: