El avance del MIT permite un etiquetado de proteínas rápido y consistente en tejidos 3D

El avance del MIT permite un etiquetado de proteínas rápido y consistente en tejidos 3D

Una nueva tecnología desarrollada en el MIT permite a los científicos etiquetar proteínas en millones de células individuales en tejidos 3D completamente intactos con una velocidad, uniformidad y versatilidad sin precedentes. La tecnología permitió al equipo etiquetar grandes cantidades de cerebro completo y otras muestras de tejido grandes en un solo día. En su nuevo estudio enbiotecnología natural,También muestran que la capacidad de marcar proteínas con anticuerpos a nivel unicelular en cerebros enteros puede revelar conocimientos ocultos por otros métodos de etiquetado ampliamente utilizados.

Perfilar las proteínas que crean las células es un elemento básico de los estudios en biología, neurociencia y campos o tratamientos relacionados. Por mucho que hayan avanzado las tecnologías de microscopía y etiquetado, permitiendo innumerables descubrimientos. Los científicos todavía carecían de una forma fiable y práctica de rastrear la expresión de proteínas a nivel de millones de células individuales densamente empaquetadas en tejidos intactos completamente en 3D, como un cerebro de ratón completo o una región completa de un cerebro humano. Los científicos a menudo se limitaban a secciones delgadas de tejido debajo de las láminas y, por lo tanto, carecían de herramientas para estimar exhaustivamente la expresión de proteínas celulares en todos los sistemas interconectados en los que ocurre.

Tradicionalmente, estudiar las moléculas en las células requiere disociar el tejido en células individuales o cortarlo en secciones delgadas porque la luz y los químicos necesarios para el análisis no pueden penetrar profundamente en el tejido. Nuestro laboratorio desarrolló tecnologías como Clarity y Shield que permiten el estudio de órganos completos haciéndolos transparentes. Ahora necesitábamos una forma de etiquetar químicamente órganos enteros para obtener conocimientos científicos útiles. Imagínese marinar un filete grueso simplemente sumergiéndolo en la salsa. Las capas exteriores absorben la marinada rápida e intensamente, mientras que las capas interiores permanecen prácticamente intactas a menos que la carne se remoje durante un período prolongado de tiempo. El mismo principio se aplica al procesamiento químico de tejidos: si las células dentro de un tejido no se procesan de manera uniforme, no se pueden comparar cuantitativamente. El desafío es aún mayor para el etiquetado de proteínas porque los químicos que utilizamos para el etiquetado son cientos de veces mayores que los de los adobos. Como resultado, estas moléculas pueden tardar semanas en difundirse en órganos intactos, lo que hace que el procesamiento químico constante del tejido del órgano sea prácticamente imposible y extremadamente lento. “

Kwanghun Chung, autor principal, profesor asociado del Instituto Picower para el Aprendizaje y la Memoria, los Departamentos de Ingeniería Química y Ciencias Cognitivas y del Cerebro, y el Instituto de Ingeniería y Ciencias Médicas del MIT

El nuevo enfoque, llamado "Curva", representa un importante paso adelante para lograr este objetivo al demostrar un enfoque fundamentalmente nuevo para procesar uniformemente tejidos grandes y densos del conjunto. En el estudio, los investigadores explican cómo superaron los obstáculos técnicos mediante una implementación de la curva llamada "Eflash" y brindan amplias demostraciones animadas de la tecnología, incluidos conocimientos de nuevos hallazgos de la neurociencia.

"Este es un salto significativo, especialmente en términos del rendimiento real de la tecnología", dijo el coautor principal Dae Hee Yun, ex estudiante de posgrado del MIT y ahora ingeniero de aplicaciones senior en LifeCanvas Technologies, una startup que Chung está difundiendo para difundir las herramientas que inventa su laboratorio. El otro autor principal del artículo es Young-Gyun Park, ex investigador postdoctoral del MIT que ahora es profesor asistente en Kaist en Corea del Sur.

química inteligente

La razón fundamental por la que las grandes muestras de tejido en 3D son uniformemente difíciles de etiquetar es que los anticuerpos penetran en el tejido muy lentamente pero se unen rápidamente a sus proteínas diana. El efecto práctico de este desajuste de velocidad es que simplemente sumergir un cerebro en un baño de anticuerpos significa que las proteínas en el borde exterior del tejido están intensamente bien marcadas, pero prácticamente ninguno de los anticuerpos encuentra células y proteínas más profundas en el interior.

Para mejorar el etiquetado, el equipo diseñó una forma (la esencia conceptual de la curva) de resolver el desajuste de velocidades. La estrategia consistió en controlar continuamente el ritmo de unión de los anticuerpos y al mismo tiempo acelerar la permeación de los anticuerpos en todo el tejido. Para descubrir cómo podría funcionar esto y optimizar el enfoque, crearon y ejecutaron una simulación computacional sofisticada que les permitió probar diferentes configuraciones y parámetros, incluidas diferentes tasas de unión y densidades y composiciones de tejido.

Luego se propusieron implementar su enfoque en tejidos reales. Su punto de partida fue una tecnología anterior llamada "interruptor", en la que el laboratorio de Chung desarrolló una forma de desactivar temporalmente la unión de anticuerpos, permitir que los anticuerpos penetren en el tejido y luego volver a activar la unión. Por la forma en que funcionó, el equipo descubrió que podría haber mejoras significativas si la tasa de unión de anticuerpos pudiera controlarse constantemente, pero los químicos utilizados en el Switch eran demasiado fuertes para un tratamiento tan continuo. Entonces, el equipo examinó una biblioteca de sustancias químicas similares para encontrar una que pudiera reducir sutil y continuamente una tasa de unión de anticuerpos más sutil y continua. Descubrieron que el ácido desoxicólico era un candidato ideal. Utilizando este producto químico, el equipo pudo modular la unión de anticuerpos no solo variando la concentración del producto químico, sino también variando el pH (o acidez) del baño de marcado.

Para acelerar el movimiento de los anticuerpos a través del tejido, el equipo utilizó otra tecnología previa inventada en el Laboratorio Chung: el electrotransporte estocástico. Esta tecnología acelera la dispersión de anticuerpos a través del tejido mediante la aplicación de campos eléctricos.

La implementación de este sistema Eflash de dispersión acelerada con velocidad de unión continuamente modificable dio como resultado una variedad de éxitos de etiquetado demostrados en el trabajo. En total, el equipo informó haber utilizado más de 60 anticuerpos diferentes para marcar proteínas en células de cerebros completos de ratones y ratas. embriones de ratón completos; otros órganos completos de ratón, incluidos los pulmones y el corazón; y bloques de tejido cerebral de animales más grandes, incluidos los humanos.

En particular, cada una de estas muestras fue marcada en un día, una velocidad "ultrarrápida" para órganos completos e intactos, dijeron los autores. Además, los diferentes preparativos no requirieron nuevos pasos de optimización.

Visualizaciones valiosas

Una de las formas en que el equipo puso a prueba Eflash fue comparar su etiquetado con otro método comúnmente utilizado: diseñar genéticamente células para que emitan fluorescencia cuando se transcribe el gen de una proteína de interés. El método genético no requiere la diseminación de anticuerpos por todo el tejido, pero puede ser propenso a discrepancias porque los informes de transcripción genética y la producción real de proteínas no son exactamente iguales. Yun agregó que, si bien el etiquetado de anticuerpos informa de manera confiable e inmediata la presencia de una proteína objetivo, el método genético puede ser mucho menos inmediato y persistente, fluorescente incluso cuando la proteína real ya no está presente.

En el estudio, el equipo utilizó ambos tipos de etiquetado simultáneamente en muestras. Cuando visualizaron las etiquetas de esta manera, vieron muchos ejemplos en los que la etiqueta de un anticuerpo y la etiqueta genética eran muy diferentes. En algunas áreas del cerebro de ratones, encontraron que dos tercios de las neuronas que expresaban PV (una proteína notable en ciertas neuronas inhibidoras) después del marcado con anticuerpos no mostraban fluorescencia de base genética. En otro ejemplo, sólo una pequeña fracción de las células que informaron la expresión mediante el método genético de una proteína llamada Chat también la informaron a través de una etiqueta de anticuerpo. En otras palabras, ha habido casos en los que el etiquetado genético, en comparación con el etiquetado de anticuerpos, subestima o revisa la expresión de proteínas.

Los investigadores no quieren insistir en el valor claro del uso de métodos de informes genéticos, sino que sugieren que el uso de etiquetado de anticuerpos en todo el órgano, como permite Eflash, también puede ayudar a poner estos datos en un contexto más rico y completo. Dado que vio casos de informes excesivos significativos de la expresión de PV en ratones (y una variación significativa entre ratones individuales).

"Nuestro descubrimiento de una gran pérdida regionalizada de neuronas inmunorreactivas PV en ratones adultos sanos y con una alta variabilidad individual resalta la importancia de los fenotipos holísticos e imparciales", escribieron los autores.

O como dijo Yun, los dos tipos diferentes de etiquetado son “dos herramientas diferentes para el trabajo”.

Además de Yun, Park y Chung, los otros autores del artículo son Jae Hun Cho, Lee Kamentsky, Nicholas Evans, Nicholas Dinapoli, Katherine Xie, Seo Woo Choi, Alexandre Albanese, Yuxuan Tian, ​​​​Chang Ho Sohn, Qiangge Zhang, Minyoung Kim, Minyoung Kim, Justin Swaney, Webster Guan, Juhyuk Park, Gabi Drummond, Heejin Choi, Luzdary Ruelas y Guoping Feng.

La financiación del estudio proviene del Fondo Burroughs Wellcome, el Programa Searle Scholars, un Premio Packard en Ciencia e Ingeniería, un Premio Narsad Joven Investigador, la Fundación McKnight, la Fundación Freedom Together, el Instituto Picower para el Aprendizaje y la Memoria, la Fundación Cultural NCSoft y los Institutos Nacionales de Salud.

Fuentes: