Proboj MIT-a omogućuje brzo i dosljedno označavanje proteina u 3D tkivima

Proboj MIT-a omogućuje brzo i dosljedno označavanje proteina u 3D tkivima

Nova tehnologija razvijena na MIT-u omogućuje znanstvenicima označavanje proteina u milijunima pojedinačnih stanica u potpuno intaktnim 3D tkivima neviđenom brzinom, ujednačenošću i svestranošću. Tehnologija je timu omogućila označavanje velikih količina cijelog mozga i drugih velikih uzoraka tkiva u jednom danu. U njihovoj novoj studiji uprirodna biotehnologija,Oni također pokazuju da sposobnost označavanja proteina antitijelima na razini jedne stanice u cijelom mozgu može otkriti uvide skrivene drugim široko korištenim metodama označavanja.

Profiliranje proteina koje stanice stvaraju sastavni je dio studija u biologiji, neuroznanosti i srodnim područjima ili liječenju. Onoliko koliko su tehnologije mikroskopije i označavanja napredovale, omogućujući bezbrojna otkrića. Znanstvenicima još uvijek nedostaje pouzdan i praktičan način za praćenje ekspresije proteina na razini milijuna gusto zbijenih pojedinačnih stanica u potpuno 3D intaktnim tkivima kao što je cijeli mozak miša ili cijela regija ljudskog mozga. Znanstvenici su često bili ograničeni na tanke presjeke tkiva ispod folija i stoga nisu imali alate za temeljitu procjenu stanične ekspresije proteina u cijelim, međusobno povezanim sustavima u kojima se ona pojavljuje.

Tradicionalno, proučavanje molekula u stanicama zahtijeva rastavljanje tkiva na pojedinačne stanice ili rezanje na tanke dijelove jer svjetlost i kemikalije potrebne za analizu ne mogu prodrijeti duboko u tkivo. Naš je laboratorij razvio tehnologije kao što su Clarity i Shield koje omogućuju proučavanje cijelih organa čineći ih transparentnima. Sada nam je trebao način da kemijski označimo cijele organe kako bismo stekli korisna znanstvena saznanja. Zamislite da marinirate debeli odrezak tako da ga jednostavno umočite u umak. Vanjski slojevi brzo i intenzivno upijaju marinadu, dok unutarnji slojevi ostaju uglavnom netaknuti osim ako se meso ne namače dulje vrijeme. Isti princip vrijedi i za kemijsku obradu tkiva: ako stanice unutar tkiva nisu ravnomjerno obrađene, ne mogu se kvantitativno usporediti. Izazov je još veći za označavanje proteina jer su kemikalije koje koristimo za označavanje stotine puta veće od onih u marinadama. Kao rezultat toga, tim molekulama mogu proći tjedni da difundiraju u intaktne organe, čineći dosljednu kemijsku obradu tkiva organa gotovo nemogućom i iznimno sporom. “

Kwanghun Chung, viši autor, izvanredni profesor na Picower institutu za učenje i pamćenje, odjelima za kemijsko inženjerstvo i mozak i kognitivne znanosti te Institutu za medicinsko inženjerstvo i znanost na MIT-u

Novi pristup, nazvan "Krivulja", predstavlja važan korak naprijed u postizanju ovog cilja pokazujući temeljno novi pristup ravnomjernoj obradi velikih i gustih tkiva cjeline. U studiji, istraživači objašnjavaju kako su prevladali tehničke prepreke kroz implementaciju krivulje nazvane "Eflash" i daju brojne živahne demonstracije tehnologije, uključujući uvide iz novih otkrića neuroznanosti.

"Ovo je značajan skok, posebno u smislu stvarne izvedbe tehnologije", rekao je jedan od glavnih autora Dae Hee Yun, bivši diplomirani student MIT-a, a sada viši inženjer aplikacija u LifeCanvas Technologies, startupu koji Chung širi kako bi proširio alate koje izumljuje njegov laboratorij. Drugi glavni autor rada je Young-Gyun Park, bivši postdoktorski istraživač na MIT-u koji je sada docent na Kaistu u Južnoj Koreji.

Pametna kemija

Temeljni razlog zašto je velike 3D uzorke tkiva jednolično teško označiti je taj što antitijela vrlo sporo prodiru u tkivo, ali se brzo vežu za svoje ciljne proteine. Praktični učinak ove neusklađenosti brzina je da jednostavno namakanje mozga u kupki antitijela znači da su proteini na vanjskom rubu tkiva intenzivno dobro označeni, ali praktički nijedno od antitijela ne nalazi stanice i proteine ​​dublje unutra.

Kako bi poboljšali označavanje, tim je dizajnirao način - konceptualnu bit krivulje - za rješavanje neusklađenosti brzina. Strategija je bila kontinuirana kontrola tempa vezanja antitijela uz ubrzavanje prodiranja antitijela kroz tkivo. Kako bi shvatili kako bi to moglo funkcionirati i optimizirali pristup, stvorili su i pokrenuli sofisticiranu računsku simulaciju koja im je omogućila testiranje različitih postavki i parametara, uključujući različite stope vezanja te gustoću i sastav tkiva.

Zatim su krenuli implementirati svoj pristup u stvarnim tkivima. Njihovo polazište bila je ranija tehnologija nazvana "switch", u kojoj je Chungov laboratorij razvio način za privremeno isključivanje vezanja antitijela, dopuštanje antitijelima da prodru u tkivo, a zatim ponovno uključivanje vezivanja. Kako je to funkcioniralo, tim je otkrio da bi moglo doći do značajnih poboljšanja ako bi se brzina vezanja antitijela mogla stalno kontrolirati, ali kemikalije korištene u Switchu bile su prejake za takav kontinuirani tretman. Stoga je tim ispitao biblioteku sličnih kemikalija kako bi pronašao onu koja bi mogla suptilno i kontinuirano smanjiti suptilniju i kontinuiraniju stopu vezanja antitijela. Otkrili su da je deoksikolna kiselina idealan kandidat. Koristeći ovu kemikaliju, tim je uspio modulirati vezanje protutijela ne samo mijenjanjem koncentracije kemikalije, već i mijenjanjem pH (ili kiselosti) kupke za označavanje.

Kako bi ubrzali kretanje antitijela kroz tkivo, tim je koristio drugu prethodnu tehnologiju izumljenu u Chung Labu: Stohastički elektrotransport. Ova tehnologija ubrzava disperziju antitijela kroz tkivo primjenom električnih polja.

Implementacija ovog ubrzanog disperzijskog Eflash sustava s kontinuirano promjenjivom brzinom uvezivanja rezultirala je nizom uspjeha u označavanju prikazanim u radu. Ukupno, tim je izvijestio da je koristio više od 60 različitih antitijela za označavanje proteina u stanicama u cijelom mozgu miševa i štakora. cijeli embriji miša; ostali cijeli mišji organi, uključujući pluća i srce; i blokovi moždanog tkiva većih životinja, uključujući ljude.

Značajno je da je svaki od ovih uzoraka označen unutar jednog dana, što je "ultrabrza" brzina za cijele, netaknute organe, rekli su autori. Osim toga, različite pripreme nisu zahtijevale nove korake optimizacije.

Vrijedne vizualizacije

Jedan od načina na koji je tim testirao Eflash bio je usporedba njegovog označavanja s drugom često korištenom metodom: genetskim inženjeringom stanice da fluoresciraju kada se transkribira gen za protein od interesa. Genetska metoda ne zahtijeva diseminaciju antitijela kroz tkivo, ali može biti sklona odstupanjima jer izvješćivanje o transkripciji gena i stvarna proizvodnja proteina nisu potpuno isti. Yun je dodao da, dok označavanje protutijela pouzdano i odmah prijavljuje prisutnost ciljnog proteina, genetska metoda može biti puno manje neposredna i postojana, fluorescirajući čak i kada stvarni protein više nije prisutan.

U studiji je tim koristio obje vrste označavanja istovremeno u uzorcima. Kada su vizualizirali oznake na ovaj način, vidjeli su mnoge primjere gdje su oznaka antitijela i genetska oznaka bile vrlo različite. U nekim područjima mišjih mozgova, otkrili su da dvije trećine neurona koji eksprimiraju PV (protein koji je primjetan u određenim inhibicijskim neuronima) nakon označavanja antitijelima ne pokazuje genetski zasnovanu fluorescenciju. U drugom primjeru, samo mali dio stanica koje su prijavile ekspresiju putem genetske metode proteina zvanog Chat također su to prijavile putem oznake antitijela. Drugim riječima, bilo je slučajeva u kojima je genetsko označavanje u usporedbi s označavanjem protutijela uvelike podcjenjivalo ili revidiralo ekspresiju proteina.

Istraživači se ne žele zadržavati na jasnoj vrijednosti korištenja metoda genetskog izvješćivanja, već umjesto toga sugeriraju da korištenje označavanja antitijela na cijelom organu, kao što Eflash dopušta, također može pomoći da se ti podaci stave u bogatiji, potpuniji kontekst. S obzirom da je vidjela slučajeve značajnog pretjeranog prijavljivanja ekspresije PV-a kod miševa (i značajne varijacije između pojedinačnih miševa).

"Naše otkriće velikog regionaliziranog gubitka PV-imunoreaktivnih neurona u zdravih odraslih miševa i s velikom individualnom varijabilnošću naglašava važnost holističkih i nepristranih fenotipova", napisali su autori.

Ili kako je Yun rekao, dvije različite vrste označavanja su "dva različita alata za posao."

Osim Yuna, Parka i Chunga, drugi autori lista su Jae Hun Cho, Lee Kamentsky, Nicholas Evans, Nicholas Dinapoli, Katherine Xie, Seo Woo Choi, Alexandre Albanese, Yuxuan Tian, ​​Chang Ho Sohn, Qiangge Zhang, Minyoung Kim, Minyoung Kim, Justin Swaney, Webster Guan, Juhyuk Park, Gabi Drummond, Heejin Choi, Luzdary Ruelas i Guoping Feng.

Financiranje studije dolazi iz Burroughs Wellcome Funda, Searle Scholars Programa, Packardove nagrade za znanost i inženjerstvo, Narsadove nagrade za mlade istraživače, Zaklade McKnight, Zaklade Freedom Together, Picower instituta za učenje i pamćenje, NCSoft Cultural Foundationa i Nacionalnog instituta za zdravlje.

Izvori: