Prielom MIT umožňuje rýchle a konzistentné značenie proteínov v 3D tkanivách

Prielom MIT umožňuje rýchle a konzistentné značenie proteínov v 3D tkanivách

Nová technológia vyvinutá na MIT umožňuje vedcom označovať proteíny v miliónoch jednotlivých buniek v úplne intaktných 3D tkanivách s bezprecedentnou rýchlosťou, jednotnosťou a všestrannosťou. Táto technológia umožnila tímu označiť veľké množstvo vzoriek celého mozgu a iných veľkých tkanív za jediný deň. Vo svojej novej štúdii vprírodné biotechnológie,Ukazujú tiež, že schopnosť označovať proteíny protilátkami na úrovni jednej bunky v celom mozgu môže odhaliť poznatky skryté inými široko používanými metódami označovania.

Profilovanie proteínov, ktoré bunky vytvárajú, je základom štúdií v biológii, neurovede a príbuzných oblastiach alebo liečbe. Rovnako ako mikroskopia a technológie označovania pokročili, čo umožňuje nespočetné množstvo objavov. Vedcom stále chýbal spoľahlivý a praktický spôsob sledovania expresie proteínov na úrovni miliónov husto zabalených jednotlivých buniek v plne 3D neporušených tkanivách, ako je celý myšací mozog alebo celá oblasť ľudského mozgu. Vedci sa často obmedzovali na tenké tkanivové rezy pod fóliami, a preto im chýbali nástroje na dôkladné odhadnutie expresie bunkových proteínov v celých, vzájomne prepojených systémoch, v ktorých sa vyskytuje.

Štúdium molekúl v bunkách tradične vyžaduje disociáciu tkaniva na jednotlivé bunky alebo rezanie na tenké rezy, pretože svetlo a chemikálie potrebné na analýzu nemôžu preniknúť hlboko do tkaniva. Naše laboratórium vyvinulo technológie ako Clarity a Shield, ktoré umožňujú štúdium celých orgánov tým, že sú transparentné. Teraz sme potrebovali spôsob, ako chemicky označiť celé orgány, aby sme získali užitočné vedecké poznatky. Predstavte si, že marinujete hustý steak tak, že ho jednoducho ponoríte do omáčky. Vonkajšie vrstvy absorbujú marinádu rýchlo a intenzívne, zatiaľ čo vnútorné vrstvy zostávajú z veľkej časti nedotknuté, pokiaľ mäso nie je namočené dlhší čas. Rovnaký princíp platí pre chemické spracovanie tkanív: ak bunky v tkanive nie sú spracované rovnomerne, nemožno ich kvantitatívne porovnávať. Výzva je ešte väčšia pri označovaní bielkovín, pretože chemikálie, ktoré používame na označovanie, sú stokrát väčšie ako chemikálie v marinádach. Výsledkom je, že týmto molekulám môže trvať týždne, kým preniknú do neporušených orgánov, čím je prakticky nemožné a extrémne pomalé konzistentné chemické spracovanie orgánového tkaniva. “

Kwanghun Chung, hlavný autor, docent na Picowerovom inštitúte pre učenie a pamäť, katedrách chemického inžinierstva a mozgových a kognitívnych vied a Ústavu lekárskeho inžinierstva a vedy na MIT

Nový prístup s názvom „Curve“ predstavuje dôležitý krok vpred pri dosahovaní tohto cieľa demonštrovaním zásadne nového prístupu k rovnomernému spracovaniu veľkých a hustých tkanív celku. V štúdii výskumníci vysvetľujú, ako prekonali technické prekážky prostredníctvom implementácie krivky s názvom „Eflash“ a poskytujú rozsiahle živé ukážky technológie vrátane poznatkov z nových poznatkov neurovedy.

„Je to významný skok, najmä pokiaľ ide o skutočný výkon technológie,“ povedal spoluautor štúdie Dae Hee Yun, bývalý študent MIT a teraz senior aplikačný inžinier v LifeCanvas Technologies, startupe, ktorý Chung šíri s cieľom rozšíriť nástroje, ktoré jeho laboratórium vynájde. Ďalším hlavným autorom článku je Young-Gyun Park, bývalý postdoktorandský výskumník MIT, ktorý je teraz odborným asistentom na Kaist v Južnej Kórei.

Inteligentná chémia

Základným dôvodom, prečo sa veľké 3D vzorky tkaniva jednotne ťažko označujú, je to, že protilátky prenikajú do tkaniva veľmi pomaly, ale rýchlo sa viažu na svoje cieľové proteíny. Praktický efekt tohto nesúladu rýchlosti je, že jednoduché namočenie mozgu do kúpeľa protilátok znamená, že proteíny na vonkajšom okraji tkaniva sú intenzívne dobre označené, ale prakticky žiadna z protilátok nenájde bunky a proteíny hlbšie vo vnútri.

Na zlepšenie označovania tím navrhol spôsob – koncepčnú podstatu krivky – ako vyriešiť nesúlad rýchlosti. Stratégiou bolo kontinuálne kontrolovať rýchlosť viazania protilátky a zároveň zrýchľovať permeáciu protilátky cez tkanivo. Aby zistili, ako by to mohlo fungovať, a optimalizovali tento prístup, vytvorili a spustili sofistikovanú výpočtovú simuláciu, ktorá im umožnila testovať rôzne nastavenia a parametre, vrátane rôznych rýchlostí viazania a hustoty a zloženia tkanív.

Potom sa pustili do implementácie svojho prístupu v reálnych tkanivách. Ich východiskovým bodom bola skoršia technológia nazývaná „switch“, v ktorej Chungovo laboratórium vyvinulo spôsob, ako dočasne vypnúť väzbu protilátky, umožniť protilátkam preniknúť do tkaniva a potom väzbu znova zapnúť. Spôsob, akým to fungovalo, tím zistil, že by mohlo dôjsť k významným zlepšeniam, ak by sa rýchlosť viazania protilátok mohla neustále kontrolovať, ale chemikálie používané v prepínači boli príliš tvrdé na takúto prebiehajúcu liečbu. Tím teda preskúmal knižnicu podobných chemikálií, aby našiel takú, ktorá by mohla jemne a nepretržite znižovať jemnejšiu a nepretržitú rýchlosť viazania protilátok. Zistili, že kyselina deoxycholová je ideálnym kandidátom. Pomocou tejto chemikálie bol tím schopný modulovať väzbu protilátky nielen zmenou koncentrácie chemikálie, ale aj zmenou pH (alebo kyslosti) značkovacieho kúpeľa.

Na urýchlenie pohybu protilátok cez tkanivo tím použil inú predchádzajúcu technológiu vynájdenú v Chung Lab: Stochastic Electrotransport. Táto technológia urýchľuje rozptyl protilátok cez tkanivo aplikáciou elektrických polí.

Implementácia tohto zrýchleného disperzného systému Eflash s kontinuálne modifikovateľnou rýchlosťou viazania viedla k rôznym úspechom pri označovaní demonštrovaných v práci. Celkovo tím ohlásil použitie viac ako 60 rôznych protilátok na označenie proteínov v bunkách v celých mozgoch myší a potkanov. celé myšacie embryá; iné celé orgány myši, vrátane pľúc a srdca; a bloky mozgového tkaniva z väčších zvierat vrátane ľudí.

Je pozoruhodné, že každý z týchto vzoriek bol označený v priebehu jedného dňa, čo je „ultrarýchle“ rýchlosť pre celé, neporušené orgány, uviedli autori. Okrem toho rôzne prípravy nevyžadovali žiadne nové optimalizačné kroky.

Hodnotné vizualizácie

Jedným zo spôsobov, ako tím Eflash testoval, bolo porovnanie jeho značenia s inou bežne používanou metódou: genetickým inžinierstvom buniek tak, aby fluoreskovali, keď sa prepíše gén pre požadovaný proteín. Genetická metóda nevyžaduje šírenie protilátok v celom tkanive, ale môže byť náchylná na nezrovnalosti, pretože vykazovanie transkripcie génu a skutočná produkcia proteínov nie sú úplne rovnaké. Yun dodal, že zatiaľ čo značenie protilátok spoľahlivo a okamžite hlási prítomnosť cieľového proteínu, genetická metóda môže byť oveľa menej bezprostredná a perzistentná, fluoreskujúca, aj keď skutočný proteín už nie je prítomný.

V štúdii tím použil oba typy označovania súčasne vo vzorkách. Keď si takto vizualizovali značky, videli veľa príkladov, kde sa označenie protilátky a genetické označenie veľmi líšili. V niektorých oblastiach mozgu myší zistili, že dve tretiny neurónov exprimujúcich PV (proteín viditeľný v určitých inhibičných neurónoch) po označení protilátkou nevykazujú geneticky podmienenú fluorescenciu. V inom príklade iba malá časť buniek, ktoré hlásili expresiu prostredníctvom genetickej metódy proteínu nazývaného Chat, to tiež hlásila prostredníctvom značky protilátky. Inými slovami, vyskytli sa prípady, keď genetické značenie v porovnaní s protilátkovým značením značne nedostatočne uvádzalo alebo revidovalo expresiu proteínov.

Výskumníci sa nechcú pozastavovať nad jasnou hodnotou používania metód genetického hlásenia, ale namiesto toho naznačujú, že používanie celoorgánového označovania protilátok, ako to umožňuje Eflash, môže tiež pomôcť umiestniť tieto údaje do bohatšieho a úplnejšieho kontextu. Vzhľadom na to, že videla prípady významného nadmerného hlásenia expresie PV u myší (a významné rozdiely medzi jednotlivými myšami).

„Náš objav veľkej regionalizovanej straty PV-imunoreaktívnych neurónov u zdravých dospelých myší a s vysokou individuálnou variabilitou zdôrazňuje dôležitosť holistických a nezaujatých fenotypov,“ napísali autori.

Alebo ako povedal Yun, dva rôzne typy označovania sú „dva rôzne nástroje pre danú prácu“.

Okrem Yuna, Parka a Chunga sú ďalšími autormi novín Jae Hun Cho, Lee Kamentsky, Nicholas Evans, Nicholas Dinapoli, Katherine Xie, Seo Woo Choi, Alexandre Albanese, Yuxuan Tian, ​​Chang Ho Sohn, Qiangge Zhang, Minyoung Kim, Minyoung Kim, Drum Jumond Guhy Park, Gabin Jumond Guhy Park, Gabin Jumond, Gabin Swaney Choi, Luzdary Ruelas a Guoping Feng.

Financovanie štúdie pochádza z Burroughs Wellcome Fund, Searle Scholars Program, Packard Award in Science and Engineering, Narsad Young Investigator Award, McKnight Foundation, Freedom Together Foundation, Picower Institute for Learning and Memory, The NCSoft Cultural Foundation a National Institutes of Health.

Zdroje: