Καθιερώθηκε μοντέλο με βάση το νεογέννητο ποντίκι που επιτρέπει τη μετάδοση κλινικών απομονώσεων SARS-CoV-2

Καθιερώθηκε μοντέλο με βάση το νεογέννητο ποντίκι που επιτρέπει τη μετάδοση κλινικών απομονώσεων SARS-CoV-2

Σε πρόσφατη μελέτη που δημοσιεύτηκε στο bioRxiv * Διακομιστής προεκτύπωσης: Ερευνητές ανέπτυξαν ένα μοντέλο νεογέννητου ποντικιού που επιτρέπει τη μετάδοση του σοβαρού οξέος αναπνευστικού συνδρόμου του κορωνοϊού 2 (SARS-CoV-2).

Studie: Ein neonatales Mausmodell charakterisiert die Übertragbarkeit von SARS-CoV-2-Varianten und zeigt eine Rolle von ORF8. Bildquelle: Dotted Yeti/Shutterstock

*Σημαντική ΣΗΜΕΙΩΣΗ:Το bioRxiv δημοσιεύει προκαταρκτικές επιστημονικές εκθέσεις που δεν έχουν αξιολογηθεί από ομοτίμους και επομένως δεν πρέπει να θεωρούνται πειστικές, που προορίζονται να καθοδηγήσουν την κλινική πρακτική/σχετική με την υγεία συμπεριφορά ή να αντιμετωπίζονται ως καθιερωμένες πληροφορίες.

φόντο

Τα χάμστερ και τα κουνάβια χρησιμοποιούνται συνήθως για τη μοντελοποίηση της παθογένεσης του SARS-CoV-2. Ωστόσο, και τα δύο ζωικά μοντέλα δεν διαθέτουν τη δυνατότητα γενετικής χειραγώγησης για την αξιολόγηση των καθοριστικών παραγόντων μετάδοσης του ιού από τον ξενιστή. Επομένως, δεν είναι σαφές ποιες αντικαταστάσεις αμινοξέων ειδικών για τον SARS-CoV-2 VOC και μηχανισμοί ξενιστή που προκαλούνται από SARS-CoV-2 συμβάλλουν στη μετάδοση.

Τα ποντίκια είναι χαμηλού κόστους και ευρέως διαθέσιμες επιλογές με ευέλικτες εργαλειοθήκες γενετικών και αντιδραστηρίων και λιγότερες προκλήσεις στην εκτροφή και τη ρύθμιση. Ωστόσο, η μετάδοση του SARS-CoV-2 σε ενήλικα ποντίκια δεν έχει τεκμηριωθεί. Οι συγγραφείς της παρούσας μελέτης καθιέρωσαν προηγουμένως νεογέννητα ποντίκια ηλικίας τεσσάρων έως επτά ημερών ως αποτελεσματικά μοντέλα μετάδοσης του IAV (ιούς της γρίπης Α).

Σχετικά με τη μελέτη

Στην παρούσα μελέτη, οι ερευνητές επέκτειναν την προηγούμενη ανάλυσή τους και παρουσίασαν ένα μοντέλο νεογνού ποντικιού που εκφράζει το ανθρώπινο ένζυμο μετατροπής της αγγειοτενσίνης 2 (hACE2) K18 που μετέδωσε τον SARS-CoV-2 και εξέτασε την προηγούμενη και τρέχουσα μετάδοση SARS-CoV-2 VOC.

Η ομάδα χαρακτήρισε τον τροπισμό SARS-CoV-2, την αναπαραγωγή και τη μετάδοση του στελέχους SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 (WA-1) σε σύγκριση με τις πτητικές οργανικές ενώσεις Alpha, Beta, Gamma, Delta και Omicron. Χαρακτήρισαν επίσης τη μετάδοση δύο ανασυνδυασμένων ιών SARS-CoV-2 που δεν διαθέτουν το πρόσθετο ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης 6 (ORF6) ή τις πρωτεΐνες ORF8. C57BL/6 (hACE2-/-) θηλυκά και C57BL/6 K18-hACE2+/+ αρσενικά ποντίκια και ποντίκια συνδυάστηκαν για να δημιουργήσουν απογόνους K18-hACE2+/- επιτρεπτούς στο WA-1. Τα νεογνά τεσσάρων έως επτά ημερών μολύνθηκαν ενδορινικά με WA-1.

Η επιβίωση και το βάρος των κουταβιών παρακολουθούνταν καθημερινά και συλλέχθηκαν δείγματα απέκκρισης (ρινικές εκκρίσεις) κατά μήκος από τα νεογνά δείκτη και τα νεογνά που είχαν στενή επαφή. Η κινητική απέκκρισης της ανώτερης αναπνευστικής οδού (URT) χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση ιογενών λοιμώξεων και η απώλεια βάρους ονομάστηκε νοσηρότητα που προκαλείται από τον SARS-CoV-2. Δείγματα ρινικής έκκρισης υποβλήθηκαν σε ποσοτικούς προσδιορισμούς ανάστροφης μεταγραφής-αλυσωτής αντίδρασης πολυμεράσης (RT-qPCR) και πραγματοποιήθηκαν δοκιμασίες πλάκας σε κύτταρα VeroE6 που υπερέκφραζαν τη διαμεμβρανική πρωτεάση σερίνη 2 (TMPRSS2) και ACE2.

Πραγματοποιήθηκε ανοσοϊστοχημική (IHC) ανάλυση στους ρινοφαρυγγικούς ιστούς των νεογνών δείκτη που χρωματίστηκαν για πρωτεΐνη νουκλεοκαψιδίου (Ν) SARS-CoV-2. Τα μολυσματικά σωματίδια SARS-CoV-2 σε ρετροτραχειακές πλύσεις και ομογενοποιήματα πνευμόνων μετρήθηκαν για την αξιολόγηση του ιικού τροπισμού για την URT και την κατώτερη αναπνευστική οδό (LRT), αντίστοιχα. Αναλύθηκαν επίσης οι κυτοκίνες που υπάρχουν στα δείγματα απέκκρισης URT από νεογέννητα ποντίκια μολυσμένα με SARS-CoV-2.

Για την αξιολόγηση της κινητικής μετάδοσης του SARS-CoV-2, χρησιμοποιήθηκε καθημερινή τήξη ποντικών επαφής ως δείκτης επιτυχούς αναπαραγωγής του ιού. Τα δείγματα απέκκρισης αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας πολυπλεξικές ενζυμικές ανοσοπροσροφητικές δοκιμασίες (ELISA). Επιπλέον, τα ποντίκια μολύνθηκαν με SARS-CoV-2 χωρίς ORF6 (WA-1 ΔORF6) ή χωρίς ORF8 (WA-1 ΔORF8) και συλλέχθηκαν δείγματα απέκκρισης, υγρά ρετροτραχειακής πλύσης και δείγματα πνεύμονα για να εκτιμηθεί η αποβολή SARS-CoV-2, η αντιγραφή URT και η αντιγραφή LRT, αντίστοιχα. Η ποσότητα του μολυσματικού ιού ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας προσδιορισμούς πλάκας.

Αποτελέσματα

Τα νεογνά ποντίκια που εκφράζουν το K18-hACE2 υποστήριξαν αποτελεσματικά τη μετάδοση του SARS-CoV-2 WA-1 και τα VOCs SARS-CoV-2 έδειξαν έντονο τροπισμό και δυναμική αναπαραγωγής στα νεογνά του δείκτη. Το ORF8 αποδείχθηκε κρίσιμο για την επιτυχή μετάδοση του SARS-CoV-2. Η νοσηρότητα και η θνησιμότητα εξισορροπήθηκαν κατά δύο έως τρεις ημέρες σε ποντίκια επαφής σε σύγκριση με τα ποντίκια δείκτη και το ριβονουκλεϊκό οξύ (RNA) SARS-CoV-2 ανιχνεύθηκε σε ποντίκια επαφής, υποδεικνύοντας τη μετάδοση του SARS-CoV-2.

Στα τέσσερα dpi, τα σωματίδια SARS-CoV-2 αποβλήθηκαν από όλα τα νεογνά επαφής, αντιπροσωπεύοντας 100% αποτελεσματικότητα μετάδοσης WA-1 και η ανίχνευση SARS-CoV-2 στα νεογέννητα ποντίκια που έριχναν δείγματα υποδηλώνει ισχυρή μόλυνση SARS-CoV-2 στην ανώτερη αναπνευστική οδό. Επιπλέον, εντοπίστηκαν κύτταρα μολυσμένα με SARS-CoV-2 στα ανώτερα οσφρητικά επιθηλιακά κύτταρα, υποδεικνύοντας την αντιγραφή του WA-1 στο URT.

Τα ποντίκια που είχαν μολυνθεί με Omicron απέκκρισαν μικρές ποσότητες SARS-CoV-2. Για το στέλεχος WA-1, οι τίτλοι SARS-CoV-2 που απεκκρίνονταν ήταν 105 μονάδες σχηματισμού πλάκας (PFU)/ml στην ανώτερη αναπνευστική οδό, αλλά σημαντικά υψηλότεροι τίτλοι (5 x 106 PFU/ml) στον πνευμονικό ιστό. Σε κορυφαίους τίτλους αντιγραφής, ο τροπισμός του στελέχους WA-1 προχώρησε προς το LRT. Αντίθετα, η αναπαραγωγή άλφα ευνόησε την URT. Τα ιικά φορτία σε όλα τα δείγματα απέκκρισης και τα αντίστοιχα δείγματα ρετροτραχειακής πλύσης ήταν παρόμοια. Με εξαίρεση το Omicron, το μοντέλο επέτρεψε σε διάφορες VOCs του SARS-CoV-2 να αναπαράγονται και να εκκρίνονται σε επίπεδα παρόμοια με το WA-1.

Επτά ημέρες μετά τη μόλυνση (dpi), τα ποντίκια επαφής με λοιμώξεις άλφα και δέλτα έδειξαν 100% θνησιμότητα, ενώ τα ποσοστά θνησιμότητας για το στέλεχος WA-1, τις λοιμώξεις από βήτα-VOC και γάμμα-VOC ήταν 75%, 86% και 56%. αντίστοιχα. Είναι πιθανό να υπήρχε μια τιμή κατωφλίου για τον τίτλο αποβολής του δείκτη (≥ 1,2 x 104 PFU/ml) στο μοντέλο για την εκτίμηση της επιτυχίας της μετάδοσης στις επαφές. Οι λοιμώξεις από στέλεχος WA-1, βήτα-VOC και γάμμα-VOC, των οποίων η μετάδοση διέφερε ως προς την έναρξη, τον χρόνο ολοκλήρωσης και τον βαθμό ολοκλήρωσης, κατέληξαν σε γενικές παρόμοιες αποκρίσεις κυτοκίνης.

Τα ιικά φορτία WA-1 ΔORF8 που απέρριψαν και τα ιικά φορτία URT ήταν 5 x 102 και 1 x 103 PFU/ml, αντίστοιχα, σημαντικά χαμηλότερα από εκείνα για το WA-1 ή το WA-1 ΔORF6, και οι μολυσματικοί ιοί εξακολουθούσαν να ανιχνεύονται σε ποντίκια δείκτη στα πέντε dpi, υποδεικνύοντας την απουσία βραδύτερης διαύγειας8. Η μετάδοση του WA-1 ΔORF8 ήταν ατελής μέχρι το τέλος του πειράματος. Επιπλέον, ο μέγιστος τίτλος ιού σε ποντίκια επαφής WA-1-ΔORF8 ήταν 7,5 × 103 PFU/ml, που ήταν χαμηλότερος από εκείνον για τα WA-1-ΔORF6 και WA-1.

Δίπλωμα

Συνολικά, τα αποτελέσματα της μελέτης έδειξαν ότι το μη επεμβατικό μοντέλο νεογνών ποντικιών μπορεί να αποκαλύψει τη δυναμική μετάδοσης των πτητικών οργανικών ενώσεων SARS-CoV-2 εκτός από το Omicron και ότι το ORF8 είναι ζωτικής σημασίας για τη μετάδοση του SARS-CoV-2.

*Σημαντική ΣΗΜΕΙΩΣΗ:Το bioRxiv δημοσιεύει προκαταρκτικές επιστημονικές εκθέσεις που δεν έχουν αξιολογηθεί από ομοτίμους και επομένως δεν πρέπει να θεωρούνται πειστικές, που προορίζονται να καθοδηγήσουν την κλινική πρακτική/σχετική με την υγεία συμπεριφορά ή να αντιμετωπίζονται ως καθιερωμένες πληροφορίες.

Αναφορά:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Rodriguez-Rodriguez, B. et al. (2022) „Ein neonatales Mausmodell charakterisiert die Übertragbarkeit von SARS-CoV-2-Varianten und zeigt eine Rolle für ORF8.“ bioRxiv. doi: 10.1101/2022.10.04.510658. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.10.04.510658v1