Opracowano nowonarodzony model mysi, który umożliwia przenoszenie klinicznych izolatów SARS-CoV-2

Opracowano nowonarodzony model mysi, który umożliwia przenoszenie klinicznych izolatów SARS-CoV-2

W niedawnym badaniu opublikowanym w bioRxiv * Serwer wydruku wstępnego: Naukowcy opracowali nowonarodzony model myszy, który umożliwia przenoszenie wirusa 2 ciężkiego ostrego zespołu oddechowego (SARS-CoV-2).

Studie: Ein neonatales Mausmodell charakterisiert die Übertragbarkeit von SARS-CoV-2-Varianten und zeigt eine Rolle von ORF8. Bildquelle: Dotted Yeti/Shutterstock

*Ważna UWAGA:bioRxiv publikuje wstępne raporty naukowe, które nie są recenzowane i dlatego nie należy ich uważać za rozstrzygające, mające na celu wytyczne dotyczące praktyki klinicznej/zachowań związanych ze zdrowiem ani traktowane jako ustalone informacje.

tło

Chomiki i fretki są rutynowo wykorzystywane do modelowania patogenezy SARS-CoV-2; Jednakże oba modele zwierzęce nie mają potencjału manipulacji genetycznej w celu oceny czynników determinujących przenoszenie wirusa. Dlatego nie jest jasne, które podstawienia aminokwasów specyficzne dla SARS-CoV-2 VOC i mechanizmy gospodarza indukowane przez SARS-CoV-2 przyczyniają się do przenoszenia.

Myszy to tania i szeroko dostępna opcja z wszechstronnymi zestawami narzędzi genetycznych i odczynników oraz mniejszymi wyzwaniami w zakresie hodowli i regulacji; Nie udokumentowano jednak przenoszenia SARS-CoV-2 na dorosłe myszy. Autorzy niniejszego badania ustalili wcześniej, że nowonarodzone myszy w wieku od czterech do siedmiu dni są skutecznymi modelami przenoszenia IAV (wirusa grypy A).

O badaniu

W niniejszym badaniu naukowcy rozszerzyli swoją poprzednią analizę i przedstawili noworodkowy mysi model K18 wykazujący ekspresję ludzkiego enzymu konwertującego angiotensynę 2 (hACE2), który przeniósł SARS-CoV-2, a także zbadał przeszłe i obecnie krążące LZO SARS-CoV-2.

Zespół scharakteryzował tropizm, replikację i przenoszenie wirusa SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 (WA-1) w porównaniu z LZO Alpha, Beta, Gamma, Delta i Omicron. Scharakteryzowali także transmisję dwóch rekombinowanych wirusów SARS-CoV-2, którym brakuje dodatkowych białek otwartej ramki odczytu 6 (ORF6) lub ORF8. Myszy i myszy C57BL/6 (hACE2-/-) i samce C57BL/6 K18-hACE2+/+ połączono w celu wytworzenia potomstwa K18-hACE2+/- podatnego na WA-1. Szczenięta indeksowe w wieku od czterech do siedmiu dni zostały zakażone donosowo WA-1.

Codziennie monitorowano przeżywalność i wagę młodych, a próbki wydzieliny (wydzieliny z nosa) pobierano wzdłużnie od młodych indeksowych i młodych pozostających z nimi w bliskim kontakcie. Do oceny infekcji wirusowych wykorzystano kinetykę wydalania górnych dróg oddechowych (URT), a utratę masy ciała nazwano zachorowalnością wywołaną SARS-CoV-2. Próbki wydzieliny z nosa poddano ilościowym testom z odwrotną transkrypcją-łańcuchową reakcją polimerazy (RT-qPCR), a testy łysinkowe przeprowadzono na komórkach VeroE6 z nadekspresją przezbłonowej proteazy seryny 2 (TMPRSS2) i ACE2.

Analizę immunohistochemiczną (IHC) przeprowadzono na tkankach nosogardła szczeniąt indeksowych barwionych na obecność białka nukleokapsydu (N) SARS-CoV-2. Zmierzono zakaźne cząsteczki SARS-CoV-2 w popłuczynach zatchawiczych i homogenatach płuc, aby ocenić tropizm wirusa odpowiednio dla URT i dolnych dróg oddechowych (LRT). Przeanalizowano także cytokiny obecne w próbkach wydalania URT od nowonarodzonych myszy zakażonych SARS-CoV-2.

Aby ocenić kinetykę przenoszenia SARS-CoV-2, codzienne linienie myszy kontaktowych wykorzystano jako wskaźnik pomyślnej replikacji wirusa. Próbki wydalin analizowano przy użyciu multipleksowych testów immunoenzymatycznych (ELISA). Ponadto myszy zakażono SARS-CoV-2 bez ORF6 (WA-1 ΔORF6) lub bez ORF8 (WA-1 ΔORF8) i pobrano próbki ich wydalin, płynów z płukania zatchawiczego i próbek płuc w celu oceny odpowiednio wydalanego SARS-CoV-2, replikacji URT i replikacji LRT. Ilość zakaźnego wirusa określono ilościowo za pomocą testów łysinkowych.

Wyniki

Nowonarodzone myszy wykazujące ekspresję K18-hACE2 skutecznie wspierały przenoszenie SARS-CoV-2 WA-1, a LZO SARS-CoV-2 wykazywały wyraźny tropizm i dynamikę replikacji u noworodków indeksowych. ORF8 okazała się kluczowa dla skutecznej transmisji SARS-CoV-2. Zachorowalność i śmiertelność równoważyły ​​się w ciągu dwóch do trzech dni u myszy kontaktowych w porównaniu z myszami indeksowymi, a u myszy kontaktowych wykryto kwas rybonukleinowy (RNA) SARS-CoV-2, co wskazuje na transmisję SARS-CoV-2.

Przy czterech dpi cząsteczki SARS-CoV-2 zostały wydalone przez wszystkie młode kontaktowe, co stanowi 100% skuteczność przenoszenia WA-1, a wykrycie SARS-CoV-2 w próbkach wydalających nowonarodzone myszy sugerowało silną infekcję SARS-CoV-2 w górnych drogach oddechowych. Ponadto w komórkach nabłonka górnego węchu zidentyfikowano komórki zakażone SARS-CoV-2, co wskazuje na replikację WA-1 w URT.

Myszy zakażone Omicronem wydaliły niewielkie ilości SARS-CoV-2. W przypadku szczepu WA-1 miano wydalonego wirusa SARS-CoV-2 wynosiło 105 jednostek tworzących łysinki (PFU)/ml w górnych drogach oddechowych, ale znacznie wyższe miana (5 x 106 PFU/ml) w tkance płuc. Przy szczytowych mianach replikacji tropizm szczepu WA-1 postępował w kierunku LRT. Wręcz przeciwnie, replikacja alfa faworyzowała URT. Miano wirusa we wszystkich próbkach wydalanych i odpowiednich próbkach z płukania zatchawiczego było podobne. Z wyjątkiem preparatu Omicron model umożliwiał replikację i wydalanie różnych LZO wirusa SARS-CoV-2 na poziomach podobnych do WA-1.

Siedem dni po zakażeniu (dpi) myszy kontaktowe z infekcjami alfa i delta wykazały 100% śmiertelność, podczas gdy wskaźniki śmiertelności w przypadku szczepu WA-1 oraz infekcji beta-VOC i gamma-VOC wynosiły 75%, 86% i 56%. odpowiednio. Jest prawdopodobne, że w modelu istniała wartość progowa wskaźnika miana wydalania (≥ 1,2 x 104 PFU/ml) umożliwiająca oszacowanie powodzenia transmisji na kontakty. Infekcje szczepem WA-1, beta-VOC i gamma-VOC, których przenoszenie różniło się początkiem, czasem zakończenia i stopniem zakończenia, spowodowały ogólnie podobne odpowiedzi cytokin.

Miano wirusa usuwanego przez WA-1 ΔORF8 i obciążenie wirusem URT wynosiło odpowiednio 5 x 102 i 1 x 103 PFU/ml, znacznie niższe niż te dla WA-1 lub WA-1 ΔORF6, a wirusy zakaźne były nadal wykrywalne u myszy indeksowych przy pięciu dpi, co wskazuje na wolniejsze spowolnienie klirensu wirusa przy braku ORF8. Transmisja WA-1 ΔORF8 była niekompletna do końca eksperymentu. Ponadto maksymalne miano wirusa u myszy kontaktowych WA-1-ΔORF8 wynosiło 7,5 x 103 PFU/ml, czyli było niższe niż w przypadku WA-1-ΔORF6 i WA-1.

Dyplom

Ogólnie rzecz biorąc, wyniki badania wykazały, że nieinwazyjny noworodkowy mysi model może ujawnić dynamikę przenoszenia LZO SARS-CoV-2 z wyjątkiem Omicron oraz że ORF8 ma kluczowe znaczenie dla przenoszenia SARS-CoV-2.

*Ważna UWAGA:bioRxiv publikuje wstępne raporty naukowe, które nie są recenzowane i dlatego nie należy ich uważać za rozstrzygające, mające na celu wytyczne dla praktyki klinicznej/zachowań związanych ze zdrowiem lub traktowane jako ustalone informacje.

Odniesienie:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Rodriguez-Rodriguez, B. et al. (2022) „Ein neonatales Mausmodell charakterisiert die Übertragbarkeit von SARS-CoV-2-Varianten und zeigt eine Rolle für ORF8.“ bioRxiv. doi: 10.1101/2022.10.04.510658. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.10.04.510658v1