تستخدم الطريقة الجديدة ملاقط نانوية لتسهيل تثبيط مروحية SARS-CoV-2 عند دقة نيوكليوتيد واحدة

تستخدم الطريقة الجديدة ملاقط نانوية لتسهيل تثبيط مروحية SARS-CoV-2 عند دقة نيوكليوتيد واحدة

وفي دراسة حديثة نشرت في com.bioRxiv * خادم ما قبل الطباعة: تصور الباحثون آلية عمل وتثبيط البروتين غير البنيوي 13 (NSP13) لفيروس كورونا المتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة 2 (SARS-CoV-2) بدقة مكانية عالية.

Studie: Hemmung der SARS-CoV-2-Helikase mit Einzelnukleotidauflösung. Bildnachweis: atdigit/Shutterstock

*ملاحظة هامة:تنشر bioRxiv تقارير علمية أولية لا تخضع لمراجعة النظراء، وبالتالي لا ينبغي اعتبارها نهائية، أو تهدف إلى توجيه الممارسة السريرية/السلوك المتعلق بالصحة، أو التعامل معها على أنها معلومات ثابتة.

خلفية

من بين جميع الـ 15 NSPs لـ SARS-COV-2، يعد NSP13، وهو عبارة عن هليكوبتر من الحمض الريبي النووي (RNA)، أمرًا بالغ الأهمية لتكراره. ومع ذلك، لا توجد حاليًا أي أدوية مضادة للفيروسات معتمدة تستهدف NSP13. على عكس البروتينات الهيكلية لـ SARS-CoV-2، يعد تسلسل الأحماض الأمينية لـ nsp13 واحدًا من أكثر التسلسلات حفظًا بين العديد من أنواع الفيروسات التاجية (CoV) (على سبيل المثال، متلازمة الشرق الأوسط التنفسية CoV) ومتغيرات SARS-CoV-2 المثيرة للقلق (VOCs). بما في ذلك أوميكرون. مجتمعة، يجعل هذا nsp13 هدفًا جذابًا مضادًا للفيروسات واسع النطاق مع إمكانية مكافحة تفشي فيروس كورونا في المستقبل.

أظهرت الدراسات الهيكلية والكيميائية الحيوية أن nsp13 عبارة عن مروحية RNA من فصيلة 1B (SF1B). إنها تستخدم آلية الدودة الخيطية للانتقال على طول ركائز الحمض النووي (NA) المفردة الذين تقطعت بهم السبل، والتي من خلالها من المحتمل أن يقوم nsp13 بفك الدوبلكس NA. ونظرًا لصغر حجم خطوته، لم تتمكن تقنيات الجزيء المفرد من فك رموز السرعة التي يتحرك بها nsp13 على طول الركيزة NA. يمكن أن يوفر هذا الحل نظرة ثاقبة حول كيفية تأثير الجزيئات المثبطة على طريقة عملها.

حول الدراسة

في الدراسة الحالية، طور الباحثون ملاقط نانوية ذات دقة جزيء واحد (SPRNT) لقياس خطوات حركة SARS-CoV-2 nsp13 على خيوط الحمض النووي. بالإضافة إلى ذلك، أظهروا كيف يمكن استخدام SPRNT لتحديد آلية عمل مثبط الهليكاز. صمم الفريق ثقبًا نانويًا واحدًا من بكتيريا Mycobacterium smegmatis porin A (MspA) داخل طبقة ثنائية فسفورية. تسبب الجهد الكهربي المطبق على هذا الغشاء في تدفق تيار من الأيونات عبر الثقب النانوي، مما يؤدي إلى سحب NA المشحونة سالبًا عبر المسام.

تسببت قواعد NA المختلفة داخل ثقب النانو في حدوث كتل تيار أيونية فريدة يمكن فك تشفيرها في تسلسل NA. تستقر المروحية المرتبطة بحبل NA الملتقط عند حافة المسام وتسحب NA، مما يؤدي إلى خطوات تيار أيوني متتالية. قام الفريق بتحليل هذه الخطوات إلى خطوات أحادية النوكليوتيدات على نطاقات زمنية أقل من المللي ثانية لمراقبة حركة المروحية على طول NA. وفي الوقت نفسه، حددوا تسلسل NA للركيزة في المروحية.

من الجدير بالذكر أيضًا أن SPRNT مارس قوة تتناسب مع الجهد المطبق على مجمع الإنزيم / NA، الذي دعم أو قاوم حركة nsp13، اعتمادًا على نهاية ثقب النانو الذي كان مرتبطًا به. بالإضافة إلى ذلك، لاحظ الفريق حركة NSP13 على طول NAs في وجود مثبط أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATPase) ATPγS.

نتائج الدراسة

سجل الباحثون 2413 حدثًا فرديًا للإزاحة والتفكيك لـ NSP13 و27641 خطوة مروحية. أكدت نتائج الدراسة أن NSP13 انتقل على طول ssDNA ودوبلكس الحمض النووي غير المجروح بمعدل حوالي 100 زوج أساسي في الثانية. كان معدل الإزفاء NSP13 يعتمد على ATP، مع الحد الأقصى لمعدل التفاعل (Vmax) بين 600 و3000 ثانية وثابت ميكايليس (Km) بين 100 و700 ميكرومتر لـ ATP، اعتمادًا على سياق التسلسل الأساسي داخل NSP13. تشير هذه الاختلافات الكبيرة في معدلات الإزاحة في مواقع مختلفة من الحمض النووي إلى أن هوية قاعدة NA أثرت على حركية الإزاحة NSP13.

وأظهرت نتائج الدراسة أيضًا أن مجمع NSP13-DNA كان أقل استقرارًا وكان من الأسهل تفككه بالقوة. لم يتسبب تغيير القوة الداعمة من ~ 24 PicoNewtons (pN) إلى ~ 44 pN عند ATP المشبع في حدوث تغيير كبير في متوسط ​​​​معدل الإزاحة لـ NSP13. علاوة على ذلك، يشير هذا إلى أن إزفاء NSP13 كان في الغالب حركة تعتمد على التحلل المائي ATP.

ووجد الباحثون أيضًا أن خطوات تفكيك وحدة dsDNA المزدوجة كانت (في المتوسط) أطول بثمانية أضعاف تقريبًا من خطوات إزاحة ssDNA. علاوة على ذلك، كان تفكيك dsDNA أبطأ من نقل ssDNA، على الرغم من ارتباط أوقات إقامتهم. ولوحظ تأثير مماثل في دراسة أخرى تفحص مروحية SF1A PcrA باستخدام SPRNT. ومن المثير للاهتمام، أن بوليميريز الحمض النووي الريبي (RdRp) المعتمد على الحمض النووي الريبي (RNA) لـ SARS-CoV-2 وNSP13 يشكل مركبًا عند حوالي 170 nt/s عند 37 درجة مئوية، على غرار ما لوحظ كسرعة تفكيك NSP13 مع SPRNT.

علاوة على ذلك، وجد الباحثون أن ATPγS يضعف عمل NSP13 من خلال عدة عمليات حركية مختلفة. ومع ذلك، فإن الآلية السائدة اعتمدت على تطبيق القوة الداعمة. على الرغم من أن ATPγS ليس مرشحًا دوائيًا قابلاً للتطبيق لـ NSP13، إلا أنه أظهر قوة SPRNT في دراسة آليات تثبيط الهليكاز. تم تحديد ثلاث طرق لتثبيط NSP13:

ط) الحد من عملياتها،

2) منع الانضمام إلى مجالاتها 1A و2A بعد ربط النوكليوتيدات و

iii) تباطؤ التحلل المائي ATPγS مقارنة بـ ATP.

الاستنتاجات

بشكل عام، سلطت الدراسة الضوء على SPRNT كأداة قيمة وقوية للتحقيق في دور NSP13 داخل مجمع النسخ والنسخ (RTC) لـ SARS-CoV-2. أظهرت طريقة SPRNT أيضًا قدرة فائقة على تسهيل دراسة حركية إزفاء NSP13 أو أي مروحية، حتى في حالة عدم وجود وحدة الطباعة على الوجهين. علاوة على ذلك، يمكن لتجارب SPRNT أن تسهل دراسة NSP13 على تسلسلات SARS-CoV-2 الأصلية لتسليط الضوء على عناصر تسلسل محددة لجينوم SARS-CoV-2 عالي التنظيم ودورها في تنظيم NSP13.

*ملاحظة هامة:تنشر bioRxiv تقارير علمية أولية لا تخضع لمراجعة النظراء، وبالتالي لا ينبغي اعتبارها نهائية، أو تهدف إلى توجيه الممارسة السريرية/السلوك المتعلق بالصحة، أو التعامل معها على أنها معلومات ثابتة.

مرجع:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Sinduja K. Marx, Keith J. Mickolajczyk, Jonathan M. Craig, Christopher A. Thomas, Akira M. Pfeffer, Sarah J. Abell, Jessica D. Carrasco, Michaela C. Franzi, Jesse R. Huang, Hwanhee C. Kim, Henry D. Brinkerhoff, Tarun M. Kapoor, Jens H. Gundlach, Andrew H. Laszlo. (2022). Hemmung der SARS-CoV-2-Helikase mit Einzelnukleotidauflösung. bioRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.10.07.511351 https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.10.07.511351v1