Новият метод използва нанопорни пинсети за улесняване на инхибирането на SARS-CoV-2 хеликазата при разделителна способност на един нуклеотид

Новият метод използва нанопорни пинсети за улесняване на инхибирането на SARS-CoV-2 хеликазата при разделителна способност на един нуклеотид

В скорошно проучване, публикувано в bioRxiv * Сървър за препечат: Изследователите визуализираха механизма на действие и инхибиране на неструктурен протеин 13 (NSP13) на коронавирус 2 на тежък остър респираторен синдром (SARS-CoV-2) с висока пространствено-времева разделителна способност.

Studie: Hemmung der SARS-CoV-2-Helikase mit Einzelnukleotidauflösung. Bildnachweis: atdigit/Shutterstock

*Важна ЗАБЕЛЕЖКА:bioRxiv публикува предварителни научни доклади, които не са рецензирани и следователно не трябва да се считат за убедителни, предназначени да насочват клиничната практика/поведение, свързано със здравето, или да се третират като установена информация.

фон

От всички 15 SARS-COV-2 NSP, NSP13, рибонуклеинова киселина (РНК) хеликаза, е от решаващо значение за неговата репликация. Понастоящем обаче няма одобрени антивирусни лекарства, насочени към NSP13. За разлика от структурните протеини на SARS-CoV-2, аминокиселинната последователност на nsp13 е една от най-запазените сред много видове коронавируси (CoV) (напр. близкоизточен респираторен синдром CoV) и варианти на SARS-CoV-2, които предизвикват безпокойство (VOC). включително Омикрон. Взети заедно, това прави nsp13 привлекателна широкоспектърна антивирусна цел с потенциал за борба с бъдещи огнища на CoV.

Структурни и биохимични изследвания показват, че nsp13 е суперсемейство 1B (SF1B) РНК хеликаза. Той използва механизъм на инчов червей за транслокация по субстрати на едноверижна (ss) нуклеинова киселина (NA), чрез които nsp13 вероятно развива дуплексите на NA. Поради малкия размер на стъпката, техниките с една молекула не успяха да дешифрират скоростта, с която nsp13 се движи по своя NA субстрат. Такава резолюция може да даде представа за това как инхибиторните молекули влияят на техния начин на действие.

Относно изследването

В настоящото изследване изследователите разработиха едномолекулни пикометърни пинсети с нанопорна разделителна способност (SPRNT), за да измерват стъпките на движение на SARS-CoV-2 nsp13 върху нишките на ДНК. В допълнение, те показаха как SPRNT може да се използва за определяне на механизма на действие на инхибитора на хеликазата. Екипът проектира единична нанопора на Mycobacterium smegmatis порин А (MspA) в рамките на фосфолипиден двоен слой. Напрежение, приложено към тази мембрана, предизвиква поток от йони да тече през нанопората, изтегляйки отрицателно заредена NA през пората.

Различни NA бази в нанопората причиняват уникални йонни токови блокове, които могат да бъдат декодирани в NA последователността. Хеликаза, свързана с уловената нишка на NA, спира на ръба на пората и издърпва NA, което води до последователни стъпки на йонен ток. Екипът ги раздели на стъпки от един нуклеотид на субмилисекундни времеви скали, за да наблюдава движението на хеликазата по NA. В същото време те определят NA последователността на субстрата в хеликазата.

Също така трябва да се отбележи, че SPRNT упражнява сила, пропорционална на приложеното напрежение върху комплекса ензим/NA, който поддържа или се съпротивлява на движението на nsp13, в зависимост от това към кой край на нанопората NA е свързан. В допълнение, екипът наблюдава движението на NSP13 по протежение на NA в присъствието на инхибитора на аденозин трифосфатаза (ATPase) ATPγS.

Резултати от изследването

Изследователите са записали 2413 индивидуални събития на транслокация и размотаване на NSP13 и 27 641 стъпки на хеликаза. Резултатите от изследването потвърдиха, че NSP13 се премества по ssDNA и размотава ДНК дуплекси със скорост от приблизително 100 базови двойки в секунда. Скоростта на транслокация на NSP13 беше зависима от ATP, с максимална скорост на реакция (Vmax) между 600 и 3000 s-1 и константа на Михаелис (Km) между 100 и 700 µM за ATP, в зависимост от контекста на основната последователност в NSP13. Такива големи разлики в скоростите на транслокация при различни позиции на ДНК предполагат, че идентичността на базата на NA повлиява кинетиката на транслокация на NSP13.

Резултатите от изследването показват също, че комплексът NSP13-ДНК е по-малко стабилен и е по-лесен за разпадане със сила. Промяната на поддържащата сила от ~ 24 PicoNewtons (pN) до ~ 44 pN при наситен ATP не доведе до значителна промяна в средната скорост на транслокация на NSP13. Освен това, това предполага, че транслокацията на NSP13 е предимно движение, задвижвано от хидролиза на АТР.

Авторите също установиха, че стъпките за размотаване на dsDNA дуплекса са (средно) почти осем пъти по-дълги от тези за ssDNA транслокация. Освен това, размотаването на dsDNA е по-бавно от транслокацията на ssDNA, въпреки че времето им на престой е корелирано. Подобен ефект се наблюдава в друго проучване, изследващо SF1A хеликазата PcrA, използвайки SPRNT. Интересното е, че РНК-зависимата РНК полимераза (RdRp) на SARS-CoV-2 и NSP13 образува комплекс при приблизително 170 nt/s при 37°C, подобно на това, което се наблюдава като скорост на размотаване на NSP13 със SPRNT.

Освен това, авторите установиха, че ATPγS нарушава действието на NSP13 чрез няколко различни кинетични процеса. Преобладаващият механизъм обаче зависеше от прилагането на поддържаща сила. Въпреки че ATPγS не е жизнеспособен кандидат за лекарство за NSP13, той демонстрира силата на SPRNT при изучаване на механизмите на инхибиране на хеликазата. Идентифицирани са три метода за инхибиране на NSP13:

i) намаляване на неговата процесорност,

ii) предотвратяване на свързването на неговите домени 1А и 2А след нуклеотидно свързване и

iii) Забавяне на хидролизата на ATPγS в сравнение с ATP.

Изводи

Като цяло, проучването подчертава SPRNT като ценен и мощен инструмент за изследване на ролята на NSP13 в комплекса за репликация и транскрипция (RTC) на SARS-CoV-2. Методът SPRNT също демонстрира превъзходна способност да улеснява изследването на кинетиката на транслокацията на NSP13 или всяка хеликаза, дори при липса на дуплекс. Освен това експериментите на SPRNT биха могли да улеснят изследването на NSP13 върху нативни последователности на SARS-CoV-2, за да хвърлят светлина върху специфични елементи на последователността на силно структурирания геном на SARS-CoV-2 и тяхната роля в регулирането на NSP13.

*Важна ЗАБЕЛЕЖКА:bioRxiv публикува предварителни научни доклади, които не са рецензирани и следователно не трябва да се считат за убедителни, предназначени да насочват клиничната практика/поведение, свързано със здравето, или да се третират като установена информация.

Справка:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Sinduja K. Marx, Keith J. Mickolajczyk, Jonathan M. Craig, Christopher A. Thomas, Akira M. Pfeffer, Sarah J. Abell, Jessica D. Carrasco, Michaela C. Franzi, Jesse R. Huang, Hwanhee C. Kim, Henry D. Brinkerhoff, Tarun M. Kapoor, Jens H. Gundlach, Andrew H. Laszlo. (2022). Hemmung der SARS-CoV-2-Helikase mit Einzelnukleotidauflösung. bioRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.10.07.511351 https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.10.07.511351v1