Nová metoda využívá nanopórové pinzety k usnadnění inhibice SARS-CoV-2 helikázy při rozlišení jednoho nukleotidu

Nová metoda využívá nanopórové pinzety k usnadnění inhibice SARS-CoV-2 helikázy při rozlišení jednoho nukleotidu

V nedávné studii publikované v bioRxiv * Předtiskový server: Výzkumníci vizualizovali mechanismus účinku a inhibici nestrukturálního proteinu 13 (NSP13) koronaviru těžkého akutního respiračního syndromu 2 (SARS-CoV-2) s vysokým časoprostorovým rozlišením.

Studie: Hemmung der SARS-CoV-2-Helikase mit Einzelnukleotidauflösung. Bildnachweis: atdigit/Shutterstock

*Důležitá POZNÁMKA:bioRxiv publikuje předběžné vědecké zprávy, které nejsou recenzovány odborníky, a proto by neměly být považovány za přesvědčivé, zamýšlené jako vodítko pro klinickou praxi/chování související se zdravím nebo s nimiž se zachází jako s ověřenými informacemi.

pozadí

Ze všech 15 SARS-COV-2 NSP je pro jeho replikaci rozhodující NSP13, helikáza ribonukleové kyseliny (RNA). V současnosti však neexistují žádná schválená antivirová léčiva, která by se zaměřovala na NSP13. Na rozdíl od strukturních proteinů SARS-CoV-2 je aminokyselinová sekvence nsp13 jednou z nejkonzervovanějších mezi mnoha typy koronavirů (CoV) (např. Middle Eastern Respiratory Syndrome CoV) a variantami SARS-CoV-2 (VOC). včetně společnosti Omicron. Dohromady to dělá z nsp13 atraktivní širokospektrální antivirový cíl s potenciálem bojovat proti budoucím epidemiím CoV.

Strukturální a biochemické studie ukázaly, že nsp13 je superrodina 1B (SF1B) RNA helikáza. Využívá mechanismus inchworm pro translokaci podél jednořetězcových (ss) substrátů nukleové kyseliny (NA), přes které nsp13 pravděpodobně odvíjí NA duplexy. Vzhledem k malé velikosti kroku nebyly techniky s jednou molekulou schopny dešifrovat rychlost, kterou se nsp13 pohybuje po svém substrátu NA. Takové rozlišení by mohlo poskytnout pohled na to, jak inhibiční molekuly ovlivňují jejich způsob působení.

O studiu

V této studii výzkumníci vyvinuli pinzetu s nanoporézním rozlišením s jednou molekulou pikometru (SPRNT) k měření kroků pohybu SARS-CoV-2 nsp13 na vláknech DNA. Kromě toho ukázali, jak lze SPRNT použít ke stanovení mechanismu účinku inhibitoru helikázy. Tým navrhl jeden nanopór Mycobacterium smegmatis porin A (MspA) ve fosfolipidové dvojvrstvě. Napětí aplikované na tuto membránu způsobilo, že proud iontů protékal nanopórem, čímž pórem vtahoval záporně nabitý NA.

Různé NA báze v nanopórech způsobily jedinečné bloky iontových proudů, které mohly být dekódovány do sekvence NA. Helikáza navázaná na zachycený NA vlákno se zastaví na okraji pórů a táhne NA, což vede k postupným krokům iontového proudu. Tým je rozložil na jednonukleotidové kroky na submilisekundových časových škálách, aby pozoroval pohyb helikázy podél NA. Zároveň určili sekvenci NA substrátu v helikáze.

Je také pozoruhodné, že SPRNT vyvíjel sílu úměrnou aplikovanému napětí na komplex enzym/NA, který podporoval nebo bránil pohybu nsp13, v závislosti na tom, ke kterému konci nanopóru NA byl vázán. Kromě toho tým pozoroval pohyb NSP13 podél NA v přítomnosti inhibitoru adenosintrifosfatázy (ATPázy) ATPγS.

Výsledky studie

Výzkumníci zaznamenali 2 413 jednotlivých událostí translokace a odvíjení NSP13 a 27 641 kroků helikázy. Výsledky studie potvrdily, že NSP13 se translokoval podél ssDNA a odvinul duplexy DNA rychlostí přibližně 100 párů bází za sekundu. Rychlost translokace NSP13 byla závislá na ATP, s maximální reakční rychlostí (Vmax) mezi 600 a 3000 s-1 a Michaelisovou konstantou (Km) mezi 100 a 700 µM pro ATP, v závislosti na základním kontextu sekvence v NSP13. Takové velké rozdíly v translokačních rychlostech v různých polohách DNA naznačují, že identita NA báze ovlivnila kinetiku translokace NSP13.

Výsledky studie také ukázaly, že komplex NSP13-DNA byl méně stabilní a bylo snazší ho rozbít silou. Změna podpůrné síly od ~24 PicoNewtonů (pN) do ~44 pN při nasyceném ATP nezpůsobila významnou změnu v průměrné rychlosti translokace NSP13. Dále to naznačuje, že translokace NSP13 byla převážně pohybem řízeným hydrolýzou ATP.

Autoři také zjistili, že kroky pro rozvinutí duplexu dsDNA byly (v průměru) téměř osmkrát delší než kroky pro translokaci ssDNA. Kromě toho bylo odvíjení dsDNA pomalejší než translokace ssDNA, ačkoli jejich doby zdržení byly korelovány. Podobný účinek byl pozorován v jiné studii zkoumající helikázu PcrA SF1A pomocí SPRNT. Je zajímavé, že RNA-dependentní RNA polymeráza (RdRp) SARS-CoV-2 a NSP13 tvoří komplex rychlostí přibližně 170 nt/s při 37 °C, což je podobné tomu, co bylo pozorováno při rychlosti odvíjení NSP13 pomocí SPRNT.

Dále autoři zjistili, že ATPyS narušuje působení NSP13 prostřednictvím několika různých kinetických procesů. Převládající mechanismus však závisel na aplikaci podpůrné síly. Ačkoli ATPγS není životaschopným lékovým kandidátem pro NSP13, prokázala sílu SPRNT při studiu mechanismů inhibice helikázy. Byly identifikovány tři způsoby inhibice NSP13:

i) snížení jeho zpracovatelnosti,

ii) zabránění spojení jeho domén 1A a 2A po nukleotidové vazbě a

iii) Zpomalení hydrolýzy ATPyS ve srovnání s ATP.

Závěry

Celkově studie vyzdvihla SPRNT jako cenný a výkonný nástroj pro zkoumání role NSP13 v rámci replikačního a transkripčního komplexu (RTC) SARS-CoV-2. Metoda SPRNT také prokázala vynikající schopnost usnadnit studium kinetiky translokace NSP13 nebo jakékoli helikázy, a to i v nepřítomnosti duplexu. Kromě toho by experimenty SPRNT mohly usnadnit studium NSP13 na nativních sekvencích SARS-CoV-2, aby osvětlily specifické sekvenční prvky vysoce strukturovaného genomu SARS-CoV-2 a jejich roli v regulaci NSP13.

*Důležitá POZNÁMKA:bioRxiv publikuje předběžné vědecké zprávy, které nejsou recenzovány odborníky, a proto by neměly být považovány za přesvědčivé, zamýšlené jako vodítko pro klinickou praxi/chování související se zdravím nebo s nimiž se zachází jako s ověřenými informacemi.

Odkaz:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Sinduja K. Marx, Keith J. Mickolajczyk, Jonathan M. Craig, Christopher A. Thomas, Akira M. Pfeffer, Sarah J. Abell, Jessica D. Carrasco, Michaela C. Franzi, Jesse R. Huang, Hwanhee C. Kim, Henry D. Brinkerhoff, Tarun M. Kapoor, Jens H. Gundlach, Andrew H. Laszlo. (2022). Hemmung der SARS-CoV-2-Helikase mit Einzelnukleotidauflösung. bioRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.10.07.511351 https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.10.07.511351v1