Νέα μέθοδος χρησιμοποιεί λαβίδες νανοπόρου για να διευκολύνει την αναστολή της ελικάσης SARS-CoV-2 σε ανάλυση ενός νουκλεοτιδίου

Νέα μέθοδος χρησιμοποιεί λαβίδες νανοπόρου για να διευκολύνει την αναστολή της ελικάσης SARS-CoV-2 σε ανάλυση ενός νουκλεοτιδίου

Σε πρόσφατη μελέτη που δημοσιεύτηκε στο bioRxiv * Διακομιστής προεκτύπωσης: Οι ερευνητές οπτικοποίησαν τον μηχανισμό δράσης και αναστολής της μη δομικής πρωτεΐνης 13 (NSP13) του σοβαρού οξέος αναπνευστικού συνδρόμου του κορωνοϊού 2 (SARS-CoV-2) με υψηλή χωροχρονική ανάλυση.

Studie: Hemmung der SARS-CoV-2-Helikase mit Einzelnukleotidauflösung. Bildnachweis: atdigit/Shutterstock

*Σημαντική ΣΗΜΕΙΩΣΗ:Το bioRxiv δημοσιεύει προκαταρκτικές επιστημονικές εκθέσεις που δεν έχουν αξιολογηθεί από ομοτίμους και επομένως δεν πρέπει να θεωρούνται πειστικές, που προορίζονται να καθοδηγήσουν την κλινική πρακτική/σχετική με την υγεία συμπεριφορά ή να αντιμετωπίζονται ως καθιερωμένες πληροφορίες.

φόντο

Από τα 15 NSP του SARS-COV-2, το NSP13, μια ελικάση ριβονουκλεϊκού οξέος (RNA), είναι ζωτικής σημασίας για την αντιγραφή του. Ωστόσο, επί του παρόντος δεν υπάρχουν εγκεκριμένα αντιιικά φάρμακα που στοχεύουν το NSP13. Σε αντίθεση με τις δομικές πρωτεΐνες SARS-CoV-2, η αλληλουχία αμινοξέων του nsp13 είναι μία από τις πιο διατηρημένες μεταξύ πολλών τύπων κορωνοϊών (CoV) (π.χ. αναπνευστικό σύνδρομο Μέσης Ανατολής CoV) και ανησυχητικές παραλλαγές SARS-CoV-2 (VOCs). συμπεριλαμβανομένου του Όμικρον. Συνολικά, αυτό καθιστά το nsp13 έναν ελκυστικό αντιιικό στόχο ευρέος φάσματος με δυνατότητα καταπολέμησης μελλοντικών εστιών CoV.

Δομικές και βιοχημικές μελέτες έχουν δείξει ότι η nsp13 είναι μια ελικάση RNA υπεροικογένειας 1B (SF1B). Χρησιμοποιεί έναν μηχανισμό inchworm για μετατόπιση κατά μήκος μονόκλωνων (ss) υποστρωμάτων νουκλεϊκού οξέος (NA), μέσω των οποίων το nsp13 πιθανώς ξετυλίγει τα διπλά NA. Λόγω του μικρού μεγέθους του βήματος, οι τεχνικές ενός μορίου δεν μπόρεσαν να αποκρυπτογραφήσουν την ταχύτητα με την οποία το nsp13 κινείται κατά μήκος του υποστρώματος NA του. Μια τέτοια ανάλυση θα μπορούσε να παρέχει μια εικόνα για το πώς τα ανασταλτικά μόρια επηρεάζουν τον τρόπο δράσης τους.

Σχετικά με τη μελέτη

Στην παρούσα μελέτη, οι ερευνητές ανέπτυξαν λαβίδες νανοπόρου ανάλυσης πικομέτρου ενός μορίου (SPRNT) για να μετρήσουν τα βήματα της κίνησης του SARS-CoV-2 nsp13 σε κλώνους DNA. Επιπλέον, έδειξαν πώς το SPRNT μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό του μηχανισμού δράσης ενός αναστολέα ελικάσης. Η ομάδα σχεδίασε έναν μόνο νανοπόρο πορίνης Α του Mycobacterium smegmatis (MspA) μέσα σε μια διπλοστοιβάδα φωσφολιπιδίων. Μια τάση που εφαρμόζεται σε αυτή τη μεμβράνη προκάλεσε ένα ρεύμα ιόντων να ρέει μέσω του νανοπόρου, τραβώντας αρνητικά φορτισμένο ΝΑ μέσω του πόρου.

Διαφορετικές βάσεις ΝΑ εντός του νανοπόρου προκάλεσαν μοναδικά μπλοκ ιοντικού ρεύματος που μπορούσαν να αποκωδικοποιηθούν στην ακολουθία ΝΑ. Μια ελικάση που είναι συνδεδεμένη με τον συλλαμβανόμενο κλώνο NA έρχεται να ακουμπήσει στην άκρη του πόρου και έλκει το ΝΑ, οδηγώντας σε διαδοχικά βήματα ιοντικού ρεύματος. Η ομάδα τα διέλυσε σε βήματα ενός νουκλεοτιδίου σε χρονικές κλίμακες υποχιλιοστά του δευτερολέπτου για να παρατηρήσει την κίνηση της ελικάσης κατά μήκος του ΝΑ. Ταυτόχρονα προσδιόρισαν την αλληλουχία ΝΑ του υποστρώματος στην ελικάση.

Είναι επίσης αξιοσημείωτο ότι το SPRNT άσκησε μια δύναμη ανάλογη με την εφαρμοζόμενη τάση στο σύμπλεγμα ενζύμου/ΝΑ, το οποίο υποστήριξε ή αντιστάθηκε στην κίνηση του nsp13, ανάλογα με το άκρο του νανοπόρου NA. Επιπλέον, η ομάδα παρατήρησε την κίνηση του NSP13 κατά μήκος των NA παρουσία του αναστολέα της τριφωσφατάσης αδενοσίνης (ATPase) ATPγS.

Αποτελέσματα μελέτης

Οι ερευνητές κατέγραψαν 2.413 μεμονωμένα συμβάντα μετατόπισης και ξετύλιξης NSP13 και 27.641 βήματα ελικάσης. Τα αποτελέσματα της μελέτης επιβεβαίωσαν ότι το NSP13 μετατοπίστηκε κατά μήκος ssDNA και ξετυλίγοντας διπλά μόρια DNA με ρυθμό περίπου 100 ζεύγη βάσεων ανά δευτερόλεπτο. Ο ρυθμός μετατόπισης NSP13 ήταν εξαρτημένος από το ATP, με τον μέγιστο ρυθμό αντίδρασης (Vmax) μεταξύ 600 και 3000 s−1 και τη σταθερά Michaelis (Km) μεταξύ 100 και 700 μM για το ATP, ανάλογα με το υποκείμενο πλαίσιο αλληλουχίας εντός του NSP13. Τέτοιες μεγάλες διαφορές στους ρυθμούς μετατόπισης σε διαφορετικές θέσεις DNA υποδηλώνουν ότι η ταυτότητα βάσης NA επηρέασε την κινητική μετατόπισης του NSP13.

Τα αποτελέσματα της μελέτης έδειξαν επίσης ότι το σύμπλεγμα NSP13-DNA ήταν λιγότερο σταθερό και ήταν ευκολότερο να διασπαστεί με δύναμη. Η μεταβολή της δύναμης υποστήριξης από ~24 PicoNewtons (pN) σε ~44 pN σε κορεσμένο ATP δεν προκάλεσε σημαντική αλλαγή στο μέσο ρυθμό μετατόπισης του NSP13. Επιπλέον, αυτό υποδηλώνει ότι η μετατόπιση του NSP13 ήταν κυρίως μια κίνηση που καθοδηγείται από την υδρόλυση ATP.

Οι συγγραφείς διαπίστωσαν επίσης ότι τα βήματα για το ξετύλιγμα της διπλής όψης dsDNA ήταν (κατά μέσο όρο) σχεδόν οκτώ φορές μεγαλύτερα από εκείνα για τη μετατόπιση ssDNA. Επιπλέον, το ξετύλιγμα του dsDNA ήταν πιο αργό από τη μετατόπιση του ssDNA, αν και οι χρόνοι παραμονής τους συσχετίστηκαν. Παρόμοιο αποτέλεσμα παρατηρήθηκε σε μια άλλη μελέτη που εξέταζε την ελικάση SF1A PcrA χρησιμοποιώντας SPRNT. Είναι ενδιαφέρον ότι η εξαρτώμενη από RNA πολυμεράση RNA (RdRp) των SARS-CoV-2 και NSP13 σχηματίζουν ένα σύμπλεγμα σε περίπου 170 nt/s στους 37°C, παρόμοιο με αυτό που παρατηρήθηκε ως ταχύτητα ξετύλιξης NSP13 με SPRNT.

Επιπλέον, οι συγγραφείς διαπίστωσαν ότι το ATPγS μείωσε τη δράση του NSP13 μέσω πολλών διαφορετικών κινητικών διεργασιών. Ωστόσο, ο κυρίαρχος μηχανισμός εξαρτιόταν από την εφαρμογή της δύναμης υποστήριξης. Αν και το ATPγS δεν είναι βιώσιμο υποψήφιο φάρμακο για το NSP13, έδειξε τη δύναμη του SPRNT στη μελέτη των μηχανισμών αναστολής της ελικάσης. Τρεις μέθοδοι αναστολής του NSP13 έχουν αναγνωριστεί:

i) μείωση της επεξεργασιμότητας του,

ii) αποτροπή της ένωσης των περιοχών του 1Α και 2Α μετά τη δέσμευση νουκλεοτιδίων και

iii) Επιβράδυνση της υδρόλυσης του ATPγS σε σύγκριση με το ATP.

συμπεράσματα

Συνολικά, η μελέτη ανέδειξε το SPRNT ως ένα πολύτιμο και ισχυρό εργαλείο για τη διερεύνηση του ρόλου του NSP13 στο σύμπλεγμα αντιγραφής και μεταγραφής (RTC) του SARS-CoV-2. Η μέθοδος SPRNT έδειξε επίσης μια ανώτερη ικανότητα να διευκολύνει τη μελέτη της κινητικής της μετατόπισης του NSP13 ή οποιασδήποτε ελικάσης, ακόμη και απουσία διπλής όψης. Επιπλέον, τα πειράματα SPRNT θα μπορούσαν να διευκολύνουν τη μελέτη του NSP13 σε εγγενείς αλληλουχίες SARS-CoV-2 για να ρίξουν φως σε συγκεκριμένα στοιχεία αλληλουχίας του εξαιρετικά δομημένου γονιδιώματος SARS-CoV-2 και στο ρόλο τους στη ρύθμιση του NSP13.

*Σημαντική ΣΗΜΕΙΩΣΗ:Το bioRxiv δημοσιεύει προκαταρκτικές επιστημονικές εκθέσεις που δεν έχουν αξιολογηθεί από ομοτίμους και επομένως δεν πρέπει να θεωρούνται πειστικές, που προορίζονται να καθοδηγήσουν την κλινική πρακτική/σχετική με την υγεία συμπεριφορά ή να αντιμετωπίζονται ως καθιερωμένες πληροφορίες.

Αναφορά:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Sinduja K. Marx, Keith J. Mickolajczyk, Jonathan M. Craig, Christopher A. Thomas, Akira M. Pfeffer, Sarah J. Abell, Jessica D. Carrasco, Michaela C. Franzi, Jesse R. Huang, Hwanhee C. Kim, Henry D. Brinkerhoff, Tarun M. Kapoor, Jens H. Gundlach, Andrew H. Laszlo. (2022). Hemmung der SARS-CoV-2-Helikase mit Einzelnukleotidauflösung. bioRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.10.07.511351 https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.10.07.511351v1