Un método novedoso utiliza pinzas de nanoporos para facilitar la inhibición de la helicasa del SARS-CoV-2 con una resolución de un solo nucleótido

Un método novedoso utiliza pinzas de nanoporos para facilitar la inhibición de la helicasa del SARS-CoV-2 con una resolución de un solo nucleótido

En un estudio reciente publicado en bioRxiv * Servidor de preimpresión: Los investigadores visualizaron el mecanismo de acción e inhibición de la proteína no estructural 13 (NSP13) del coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo grave (SARS-CoV-2) con alta resolución espaciotemporal.

Studie: Hemmung der SARS-CoV-2-Helikase mit Einzelnukleotidauflösung. Bildnachweis: atdigit/Shutterstock

*NOTA IMPORTANTE:bioRxiv publica informes científicos preliminares que no están revisados ​​por pares y, por lo tanto, no deben considerarse concluyentes, no pretenden guiar la práctica clínica o el comportamiento relacionado con la salud, ni tratarse como información establecida.

fondo

De los 15 NSP del SARS-COV-2, NSP13, una helicasa del ácido ribonucleico (ARN), es crucial para su replicación. Sin embargo, actualmente no existen medicamentos antivirales aprobados que se dirijan a NSP13. A diferencia de las proteínas estructurales del SARS-CoV-2, la secuencia de aminoácidos de nsp13 es una de las más conservadas entre muchos tipos de coronavirus (CoV) (por ejemplo, el síndrome respiratorio de Oriente Medio CoV) y variantes preocupantes (COV) del SARS-CoV-2. incluido Omicron. En conjunto, esto convierte a nsp13 en un objetivo antiviral atractivo de amplio espectro con potencial para combatir futuros brotes de CoV.

Los estudios estructurales y bioquímicos han demostrado que nsp13 es una ARN helicasa de la superfamilia 1B (SF1B). Utiliza un mecanismo de gusano para la translocación a lo largo de sustratos de ácido nucleico (NA) monocatenario (ss), a través del cual nsp13 probablemente desenrolla los dúplex de NA. Debido a su pequeño tamaño de paso, las técnicas de molécula única no pudieron descifrar la velocidad a la que nsp13 se mueve a lo largo de su sustrato NA. Esta resolución podría proporcionar información sobre cómo las moléculas inhibidoras influyen en su modo de acción.

Sobre el estudio

En el presente estudio, los investigadores desarrollaron pinzas de nanoporos con resolución picómetro de una sola molécula (SPRNT) para medir los pasos del movimiento nsp13 del SARS-CoV-2 en las hebras de ADN. Además, mostraron cómo se puede utilizar SPRNT para determinar el mecanismo de acción de un inhibidor de la helicasa. El equipo diseñó un único nanoporo de porina A de Mycobacterium smegmatis (MspA) dentro de una bicapa de fosfolípidos. Un voltaje aplicado a esta membrana provocó que una corriente de iones fluyera a través del nanoporo, atrayendo NA cargado negativamente a través del poro.

Diferentes bases de NA dentro del nanoporo provocaron bloques de corriente iónica únicos que podrían decodificarse en la secuencia de NA. Una helicasa unida a la cadena de NA capturada se detiene en el borde del poro y tira de la NA, lo que lleva a pasos sucesivos de corriente iónica. El equipo los resolvió en pasos de un solo nucleótido en escalas de tiempo de submilisegundos para observar el movimiento de la helicasa a lo largo de la NA. Al mismo tiempo determinaron la secuencia NA del sustrato de la helicasa.

También es digno de mención que SPRNT ejerció una fuerza proporcional al voltaje aplicado en el complejo enzima/NA, que apoyó o resistió el movimiento de nsp13, dependiendo de a qué extremo del nanoporo estaba unido NA. Además, el equipo observó el movimiento de NSP13 a lo largo de las NA en presencia del inhibidor de la adenosina trifosfatasa (ATPasa), ATPγS.

Resultados del estudio

Los investigadores registraron 2.413 eventos individuales de translocación y desenrollamiento de NSP13 y 27.641 pasos de helicasa. Los resultados del estudio confirmaron que NSP13 se translocó a lo largo del ssDNA y desenrolló los dúplex de ADN a una velocidad de aproximadamente 100 pares de bases por segundo. La tasa de translocación de NSP13 dependía del ATP, con la velocidad de reacción máxima (Vmax) entre 600 y 3000 s-1 y la constante de Michaelis (Km) entre 100 y 700 µM para ATP, dependiendo del contexto de secuencia subyacente dentro de NSP13. Diferencias tan grandes en las tasas de translocación en diferentes posiciones del ADN sugirieron que la identidad de la base de NA influyó en la cinética de translocación de NSP13.

Los resultados del estudio también mostraron que el complejo NSP13-ADN era menos estable y más fácil de romper con fuerza. Variar la fuerza de apoyo de ~24 PicoNewtons (pN) a ~44 pN en ATP saturado no causó un cambio significativo en la tasa de translocación promedio de NSP13. Además, esto sugirió que la translocación de NSP13 era predominantemente un movimiento impulsado por la hidrólisis de ATP.

Los autores también descubrieron que los pasos para desenrollar el dúplex de ADNds eran (en promedio) casi ocho veces más largos que los de la translocación de ADNss. Además, el desenrollado del dsDNA fue más lento que la translocación del ssDNA, aunque sus tiempos de residencia estaban correlacionados. Se observó un efecto similar en otro estudio que examinó la helicasa PcrA SF1A utilizando SPRNT. Curiosamente, la ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp) del SARS-CoV-2 y NSP13 forma un complejo a aproximadamente 170 nt/s a 37 °C, similar a lo que se observó como velocidad de desenrollamiento de NSP13 con SPRNT.

Además, los autores descubrieron que el ATPγS alteraba la acción de NSP13 a través de varios procesos cinéticos diferentes. Sin embargo, el mecanismo predominante dependía de la aplicación de fuerza de apoyo. Aunque ATPγS no es un fármaco candidato viable para NSP13, demostró el poder de SPRNT en el estudio de los mecanismos de inhibición de la helicasa. Se han identificado tres métodos de inhibición de NSP13:

i) reducir su procesividad,

ii) impedir la unión de sus dominios 1A y 2A después de la unión de nucleótidos y

iii) Enlentecimiento de la hidrólisis de ATPγS en comparación con el ATP.

Conclusiones

En general, el estudio destacó a SPRNT como una herramienta valiosa y poderosa para investigar el papel de NSP13 dentro del complejo de replicación y transcripción (RTC) del SARS-CoV-2. El método SPRNT también demostró una capacidad superior para facilitar el estudio de la cinética de la translocación de NSP13 o cualquier helicasa, incluso en ausencia de un dúplex. Además, los experimentos SPRNT podrían facilitar el estudio de NSP13 en secuencias nativas del SARS-CoV-2 para arrojar luz sobre elementos de secuencia específicos del genoma altamente estructurado del SARS-CoV-2 y su papel en la regulación de NSP13.

*NOTA IMPORTANTE:bioRxiv publica informes científicos preliminares que no están revisados ​​por pares y, por lo tanto, no deben considerarse concluyentes, no pretenden guiar la práctica clínica o el comportamiento relacionado con la salud, ni tratarse como información establecida.

Referencia:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Sinduja K. Marx, Keith J. Mickolajczyk, Jonathan M. Craig, Christopher A. Thomas, Akira M. Pfeffer, Sarah J. Abell, Jessica D. Carrasco, Michaela C. Franzi, Jesse R. Huang, Hwanhee C. Kim, Henry D. Brinkerhoff, Tarun M. Kapoor, Jens H. Gundlach, Andrew H. Laszlo. (2022). Hemmung der SARS-CoV-2-Helikase mit Einzelnukleotidauflösung. bioRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.10.07.511351 https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.10.07.511351v1