Uudne meetod kasutab nanopoorseid pintsette, et hõlbustada SARS-CoV-2 helikaasi inhibeerimist ühe nukleotiidi eraldusvõimega

Uudne meetod kasutab nanopoorseid pintsette, et hõlbustada SARS-CoV-2 helikaasi inhibeerimist ühe nukleotiidi eraldusvõimega

aastal avaldatud hiljutises uuringus bioRxiv * Eelprintserver: teadlased visualiseerisid raske ägeda respiratoorse sündroomi koroonaviiruse 2 (SARS-CoV-2) mittestruktuurse valgu 13 (NSP13) toimemehhanismi ja inhibeerimist kõrge ajaruumilise eraldusvõimega.

Studie: Hemmung der SARS-CoV-2-Helikase mit Einzelnukleotidauflösung. Bildnachweis: atdigit/Shutterstock

*Oluline MÄRKUS:bioRxiv avaldab esialgseid teaduslikke aruandeid, mida ei ole eelretsenseeritud ja mida ei tohiks seetõttu pidada lõplikuks, mis on mõeldud kliinilise praktika/tervisega seotud käitumise suunamiseks ega käsitletud teabena.

taustal

Kõigist 15 SARS-COV-2 NSP-st on NSP13, ribonukleiinhappe (RNA) helikaas, selle replikatsiooni jaoks ülioluline. Siiski ei ole praegu ühtegi heakskiidetud viirusevastast ravimit, mis oleks suunatud NSP13-le. Erinevalt SARS-CoV-2 struktuurvalkudest on nsp13 aminohappejärjestus üks konserveeritumaid paljude koroonaviiruste (CoV) tüüpide (nt Lähis-Ida respiratoorse sündroomi CoV) ja SARS-CoV-2 probleemsete variantide (VOC) hulgas. sealhulgas Omicron. Kokkuvõttes teeb see nsp13 atraktiivseks laia toimespektriga viirusevastaseks sihtmärgiks, millel on potentsiaal võidelda tulevaste CoV puhangutega.

Struktuuri- ja biokeemilised uuringud on näidanud, et nsp13 on superperekonna 1B (SF1B) RNA helikaas. See kasutab inchworm mehhanismi translokatsiooniks mööda üheahelalisi (ss) nukleiinhappe (NA) substraate, mille kaudu nsp13 tõenäoliselt NA duplekse lahti kerib. Väikese sammu suuruse tõttu ei suutnud ühemolekulitehnikad dešifreerida kiirust, millega nsp13 liigub mööda oma NA substraati. Selline lahendus võib anda ülevaate sellest, kuidas inhibeerivad molekulid mõjutavad nende toimeviisi.

Uuringu kohta

Käesolevas uuringus töötasid teadlased välja ühe molekuli pikomeetri eraldusvõimega nanopoorpintsetid (SPRNT), et mõõta SARS-CoV-2 nsp13 liikumise etappe DNA ahelatel. Lisaks näitasid nad, kuidas SPRNT abil saab määrata helikaasi inhibiitori toimemehhanismi. Meeskond kujundas fosfolipiidide kaksikkihis ühe Mycobacterium smegmatis porin A (MspA) nanopoori. Sellele membraanile rakendatud pinge põhjustas ioonide voolu, mis voolas läbi nanopoori, tõmmates läbi pooride negatiivse laenguga NA.

Erinevad NA-alused nanopooris põhjustasid ainulaadseid ioonvooluplokke, mida sai dekodeerida NA järjestusse. Püütud NA ahelaga seotud helikaas peatub pooride serval ja tõmbab NA-d, mis viib järjestikuste ioonvoolu etappideni. Meeskond lahendas need ühe nukleotiidi etappideks submillisekunditel, et jälgida helikaasi liikumist piki NA-d. Samal ajal määrasid nad helikaasi substraadi NA järjestuse.

Samuti on tähelepanuväärne, et SPRNT avaldas ensüümi / NA kompleksile rakendatud pingega võrdelist jõudu, mis toetas või takistas nsp13 liikumist, sõltuvalt sellest, millise nanopoori NA otsaga oli seotud. Lisaks jälgis meeskond NSP13 liikumist mööda NA-sid adenosiintrifosfataasi (ATPaasi) inhibiitori ATPγS juuresolekul.

Uuringu tulemused

Teadlased registreerisid 2413 individuaalset NSP13 translokatsiooni ja lahtikerimise sündmust ning 27 641 helikaasi sammu. Uuringu tulemused kinnitasid, et NSP13 translokeerus mööda ssDNA-d ja lahtikeeratud DNA duplekse kiirusega ligikaudu 100 aluspaari sekundis. NSP13 translokatsioonikiirus sõltus ATP-st, maksimaalne reaktsioonikiirus (Vmax) oli vahemikus 600 kuni 3000 s-1 ja Michaelise konstant (Km) vahemikus 100 kuni 700 µM ATP puhul, sõltuvalt NSP13 aluseks olevast järjestuse kontekstist. Sellised suured erinevused translokatsioonikiirustes erinevates DNA positsioonides viitasid sellele, et NA aluse identsus mõjutas NSP13 translokatsiooni kineetikat.

Uuringutulemused näitasid ka, et NSP13-DNA kompleks oli vähem stabiilne ja seda oli kergem jõuga lahti murda. Toetava jõu muutmine ~ 24 PicoNewtonilt (pN) ~ 44 pN-ni küllastunud ATP juures ei põhjustanud olulist muutust NSP13 keskmises translokatsioonikiiruses. Lisaks viitas see sellele, et NSP13 translokatsioon oli valdavalt ATP hüdrolüüsist tingitud liikumine.

Autorid leidsid ka, et dsDNA dupleksi lahtikerimise etapid olid (keskmiselt) peaaegu kaheksa korda pikemad kui ssDNA translokatsiooni etapid. Lisaks oli dsDNA lahtikerimine aeglasem kui ssDNA translokatsioon, kuigi nende viibimisajad olid korrelatsioonis. Sarnast efekti täheldati teises uuringus, milles uuriti SF1A helikaasi PcrA, kasutades SPRNT. Huvitav on see, et SARS-CoV-2 ja NSP13 RNA-sõltuv RNA polümeraas (RdRp) moodustab kompleksi umbes 170 nt/s temperatuuril 37 °C, sarnaselt sellele, mida täheldati NSP13 lahtikerimiskiirusena SPRNT-ga.

Lisaks leidsid autorid, et ATPγS kahjustas NSP13 toimet mitme erineva kineetilise protsessi kaudu. Valdav mehhanism sõltus aga tugijõu rakendamisest. Kuigi ATPγS ei ole NSP13 jaoks elujõuline ravimikandidaat, näitas see SPRNT võimet helikaasi inhibeerimise mehhanismide uurimisel. NSP13 inhibeerimiseks on tuvastatud kolm meetodit:

i) selle protsessilisuse vähendamine,

ii) takistab selle domeenide 1A ja 2A liitumist pärast nukleotiidide sidumist ja

iii) ATPγS hüdrolüüsi aeglustumine võrreldes ATP-ga.

Järeldused

Üldiselt tõstis uuring SPRNT esile kui väärtuslikku ja võimsat vahendit NSP13 rolli uurimiseks SARS-CoV-2 replikatsiooni- ja transkriptsioonikompleksis (RTC). SPRNT-meetod näitas ka paremat võimet hõlbustada NSP13 translokatsiooni või mis tahes helikaasi kineetika uurimist isegi dupleksi puudumisel. Lisaks võivad SPRNT katsed hõlbustada NSP13 uurimist natiivsetel SARS-CoV-2 järjestustel, et valgustada kõrgelt struktureeritud SARS-CoV-2 genoomi spetsiifilisi järjestuse elemente ja nende rolli NSP13 regulatsioonis.

*Oluline MÄRKUS:bioRxiv avaldab esialgseid teaduslikke aruandeid, mida ei ole eelretsenseeritud ja mida ei tohiks seetõttu pidada lõplikuks, mis on mõeldud kliinilise praktika/tervisega seotud käitumise suunamiseks ega käsitletud teabena.

Viide:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Sinduja K. Marx, Keith J. Mickolajczyk, Jonathan M. Craig, Christopher A. Thomas, Akira M. Pfeffer, Sarah J. Abell, Jessica D. Carrasco, Michaela C. Franzi, Jesse R. Huang, Hwanhee C. Kim, Henry D. Brinkerhoff, Tarun M. Kapoor, Jens H. Gundlach, Andrew H. Laszlo. (2022). Hemmung der SARS-CoV-2-Helikase mit Einzelnukleotidauflösung. bioRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.10.07.511351 https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.10.07.511351v1