Uusi menetelmä käyttää nanohuokospinsettejä helpottamaan SARS-CoV-2-helikaasin estoa yhden nukleotidin resoluutiolla

Uusi menetelmä käyttää nanohuokospinsettejä helpottamaan SARS-CoV-2-helikaasin estoa yhden nukleotidin resoluutiolla

Äskettäin julkaistussa tutkimuksessa bioRxiv * Preprint-palvelin: Tutkijat visualisoivat vakavan akuutin hengitystieoireyhtymän koronaviruksen 2 (SARS-CoV-2) ei-rakenteellisen proteiinin 13 (NSP13) vaikutusmekanismin ja eston korkealla spatiotemporaalisella resoluutiolla.

Studie: Hemmung der SARS-CoV-2-Helikase mit Einzelnukleotidauflösung. Bildnachweis: atdigit/Shutterstock

*Tärkeä HUOMAUTUS:bioRxiv julkaisee alustavia tieteellisiä raportteja, joita ei ole vertaisarvioitu ja joita ei siksi pitäisi pitää vakuuttavina, jotka on tarkoitettu ohjaamaan kliinistä käytäntöä/terveyteen liittyvää käyttäytymistä tai joita ei pitäisi käsitellä vakiintuneina tietoina.

tausta

Kaikista 15 SARS-COV-2 NSP:stä NSP13, ribonukleiinihappo (RNA) helikaasi, on ratkaiseva sen replikaatiolle. Tällä hetkellä ei kuitenkaan ole hyväksyttyjä viruslääkkeitä, jotka kohdistuvat NSP13:een. Toisin kuin SARS-CoV-2:n rakenneproteiinit, nsp13:n aminohapposekvenssi on yksi konservoituneimmista monien koronavirustyyppien (CoV) (esim. Lähi-idän hengitystieoireyhtymän CoV) ja SARS-CoV-2-varianttien (VOC) joukossa. mukaan lukien Omicron. Yhdessä tämä tekee nsp13:sta houkuttelevan laaja-alaisen antiviraalisen kohteen, jolla on potentiaalia torjua tulevia CoV-epidemiaa.

Rakenteelliset ja biokemialliset tutkimukset ovat osoittaneet, että nsp13 on superperheen 1B (SF1B) RNA-helikaasi. Se käyttää inchworm-mekanismia translokaatioon yksijuosteisia (ss) nukleiinihapposubstraatteja (NA) pitkin, jonka kautta nsp13 todennäköisesti purkaa NA-duplekseja. Pienen askelkoonsa vuoksi yksimolekyyliset tekniikat eivät kyenneet tulkitsemaan nopeutta, jolla nsp13 liikkuu NA-substraattiaan pitkin. Tällainen resoluutio voisi antaa käsityksen siitä, kuinka estävät molekyylit vaikuttavat niiden toimintatapaan.

Tietoja tutkimuksesta

Tässä tutkimuksessa tutkijat kehittivät yhden molekyylin pikometriresoluutioisia nanohuokopinsettejä (SPRNT) mittaamaan SARS-CoV-2 nsp13:n liikkeen vaiheita DNA-säikeissä. Lisäksi he osoittivat, kuinka SPRNT:tä voidaan käyttää helikaasin estäjän vaikutusmekanismin määrittämiseen. Ryhmä suunnitteli yhden Mycobacterium smegmatis porin A:n (MspA) nanohuokosen fosfolipidikaksoiskerroksen sisään. Tähän kalvoon kohdistettu jännite sai ionivirran virtaamaan nanohuokosen läpi, mikä veti negatiivisesti varautunutta NA:ta huokosten läpi.

Erilaiset NA-emäkset nanohuokosessa aiheuttivat ainutlaatuisia ionivirtalohkoja, jotka voitiin dekoodata NA-sekvenssiksi. Siepatuun NA-juosteeseen sitoutunut helikaasi pysähtyy huokosen reunaan ja vetää NA:ta, mikä johtaa peräkkäisiin ionivirran vaiheisiin. Tiimi ratkaisi nämä yhden nukleotidin vaiheiksi alimillisekunnin aika-asteikoilla tarkkaillakseen helikaasin liikettä NA:ta pitkin. Samaan aikaan he määrittelivät helikaasin substraatin NA-sekvenssin.

On myös huomionarvoista, että SPRNT kohdistaa voiman, joka oli verrannollinen käytettyyn jännitteeseen entsyymi/NA-kompleksiin, joka tuki tai vastusti nsp13:n liikettä riippuen siitä, mihin nanohuokosen päähän NA oli sitoutunut. Lisäksi ryhmä tarkkaili NSP13:n liikettä NA:ita pitkin adenosiinitrifosfataasin (ATPaasi) estäjän ATPyS:n läsnä ollessa.

Tutkimustulokset

Tutkijat kirjasivat 2 413 yksittäistä NSP13:n translokaatio- ja purkamistapahtumaa ja 27 641 helikaasivaihetta. Tutkimustulokset vahvistivat, että NSP13 siirtyi pitkin ssDNA:ta ja purkautuneita DNA-duplekseja nopeudella noin 100 emäsparia sekunnissa. NSP13:n translokaationopeus oli ATP:stä riippuvainen, maksimireaktionopeuden (Vmax) ollessa välillä 600-3000 s-1 ja Michaelis-vakion (Km) välillä 100-700 µM ATP:lle riippuen NSP13:n taustalla olevasta sekvenssikontekstista. Tällaiset suuret erot translokaationopeuksissa eri DNA-kohdissa viittasivat siihen, että NA-emäksen identiteetti vaikutti NSP13:n translokaatiokinetiikkaan.

Tutkimustulokset osoittivat myös, että NSP13-DNA-kompleksi oli vähemmän stabiili ja se oli helpompi hajottaa voimalla. Tukivoiman vaihtelu ~24 PicoNewtonista (pN) ~44 pN:iin kyllästetyllä ATP:llä ei aiheuttanut merkittävää muutosta NSP13:n keskimääräisessä translokaationopeudessa. Lisäksi tämä viittasi siihen, että NSP13:n translokaatio oli pääasiassa ATP-hydrolyysilähtöistä liikettä.

Kirjoittajat havaitsivat myös, että dsDNA-dupleksin purkamisvaiheet olivat (keskimäärin) lähes kahdeksan kertaa pidempiä kuin ssDNA-translokaatiovaiheet. Lisäksi dsDNA:n purkautuminen oli hitaampaa kuin ssDNA:n translokaatio, vaikka niiden viipymisajat korreloivat. Samanlainen vaikutus havaittiin toisessa tutkimuksessa, jossa tutkittiin SF1A-helikaasi PcrA käyttämällä SPRNT:tä. Mielenkiintoista on, että SARS-CoV-2:n ja NSP13:n RNA-riippuvainen RNA-polymeraasi (RdRp) muodostaa kompleksin noin 170 nt/s 37 °C:ssa, joka on samanlainen kuin mitä havaittiin NSP13:n purkautumisnopeudena SPRNT:n kanssa.

Lisäksi kirjoittajat havaitsivat, että ATPyS heikensi NSP13:n toimintaa useiden eri kineettisten prosessien kautta. Vallitseva mekanismi riippui kuitenkin tukivoiman käytöstä. Vaikka ATPyS ei ole elinkelpoinen lääkekandidaatti NSP13:lle, se osoitti SPRNT:n tehon helikaasin eston mekanismien tutkimisessa. NSP13:n estämiseksi on tunnistettu kolme menetelmää:

i) vähentää sen prosessoivisuutta,

ii) estää sen domeenien 1A ja 2A liittymisen nukleotidien sitoutumisen jälkeen ja

iii) ATPyS-hydrolyysin hidastuminen verrattuna ATP:hen.

Johtopäätökset

Insgesamt wurde in der Studie SPRNT als wertvolles und leistungsstarkes Instrument zur Untersuchung der Rolle von NSP13 innerhalb des Replikations- und Transkriptionskomplexes (RTC) von SARS-CoV-2 hervorgehoben. Die SPRNT-Methode zeigte auch eine überlegene Fähigkeit, die Untersuchung der Kinetik der NSP13-Translokation oder einer beliebigen Helikase zu erleichtern, selbst ohne Duplex. Darüber hinaus könnten SPRNT-Experimente die Untersuchung von NSP13 an nativen SARS-CoV-2-Sequenzen erleichtern, um Aufschluss über spezifische Sequenzelemente des hochstrukturierten SARS-CoV-2-Genoms und ihre Rolle bei der NSP13-Regulation zu geben.

*Tärkeä HUOMAUTUS:bioRxiv julkaisee alustavia tieteellisiä raportteja, joita ei ole vertaisarvioitu ja joita ei siksi pitäisi pitää vakuuttavina, jotka on tarkoitettu ohjaamaan kliinistä käytäntöä/terveyteen liittyvää käyttäytymistä tai joita ei pitäisi käsitellä vakiintuneina tietoina.

Viite:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Sinduja K. Marx, Keith J. Mickolajczyk, Jonathan M. Craig, Christopher A. Thomas, Akira M. Pfeffer, Sarah J. Abell, Jessica D. Carrasco, Michaela C. Franzi, Jesse R. Huang, Hwanhee C. Kim, Henry D. Brinkerhoff, Tarun M. Kapoor, Jens H. Gundlach, Andrew H. Laszlo. (2022). Hemmung der SARS-CoV-2-Helikase mit Einzelnukleotidauflösung. bioRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.10.07.511351 https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.10.07.511351v1