Nova metoda koristi nanopore pincete za olakšavanje inhibicije SARS-CoV-2 helikaze pri rezoluciji jednog nukleotida

Nova metoda koristi nanopore pincete za olakšavanje inhibicije SARS-CoV-2 helikaze pri rezoluciji jednog nukleotida

U nedavnoj studiji objavljenoj u bioRxiv * Preprint poslužitelj: Istraživači su vizualizirali mehanizam djelovanja i inhibicije nestrukturnog proteina 13 (NSP13) teškog akutnog respiratornog sindroma koronavirusa 2 (SARS-CoV-2) s visokom prostorno-vremenskom rezolucijom.

Studie: Hemmung der SARS-CoV-2-Helikase mit Einzelnukleotidauflösung. Bildnachweis: atdigit/Shutterstock

*Važna NAPOMENA:bioRxiv objavljuje preliminarna znanstvena izvješća koja nisu recenzirana i stoga se ne bi trebala smatrati uvjerljivima, namijenjena usmjeravanju kliničke prakse/ponašanja u vezi sa zdravljem, niti ih treba tretirati kao utvrđenu informaciju.

pozadina

Od svih 15 SARS-COV-2 NSP-ova, NSP13, helikaza ribonukleinske kiseline (RNA), ključna je za njegovu replikaciju. Međutim, trenutno ne postoje odobreni antivirusni lijekovi koji ciljaju na NSP13. Za razliku od strukturnih proteina SARS-CoV-2, aminokiselinska sekvenca nsp13 jedna je od najočuvanijih među mnogim vrstama koronavirusa (CoV) (npr. Bliskoistočni respiratorni sindrom CoV) i zabrinjavajućim varijantama SARS-CoV-2 (VOC). uključujući Omicron. Sve zajedno, to čini nsp13 atraktivnom antivirusnom metom širokog spektra s potencijalom za borbu protiv budućih epidemija CoV-a.

Strukturne i biokemijske studije pokazale su da je nsp13 RNA helikaza superfamilije 1B (SF1B). Koristi mehanizam inchworm za translokaciju duž jednolančanih (ss) supstrata nukleinske kiseline (NA), kroz koje nsp13 vjerojatno odmotava duplekse NA. Zbog svoje male veličine koraka, tehnike jedne molekule nisu mogle dešifrirati brzinu kojom se nsp13 kreće duž svog NA supstrata. Takva rezolucija mogla bi dati uvid u to kako inhibitorne molekule utječu na svoj način djelovanja.

O studiju

U ovoj studiji istraživači su razvili nanopore pincete rezolucije jedne molekule pikometra (SPRNT) za mjerenje koraka kretanja SARS-CoV-2 nsp13 na lancima DNK. Osim toga, pokazali su kako se SPRNT može koristiti za određivanje mehanizma djelovanja inhibitora helikaze. Tim je dizajnirao jednu nanoporu Mycobacterium smegmatis porina A (MspA) unutar fosfolipidnog dvosloja. Napon primijenjen na ovu membranu uzrokovao je protok iona kroz nanopore, povlačeći negativno nabijenu NA kroz pore.

Različite baze NA unutar nanopore uzrokovale su jedinstvene blokove ionske struje koji se mogu dekodirati u sekvencu NA. Helikaza vezana za uhvaćeni NA lanac se zaustavlja na rubu pore i povlači NA, što dovodi do uzastopnih koraka ionske struje. Tim ih je razdvojio u korake od jednog nukleotida na vremenskim skalama od submilisekunde kako bi promatrao kretanje helikaze duž NA. Istodobno su odredili NA sekvencu supstrata u helikazi.

Također je važno spomenuti da je SPRNT izvršio silu proporcionalnu primijenjenom naponu na kompleks enzim/NA, koji je podržavao ili odupirao kretanju nsp13, ovisno o tome na koji je kraj nanopore NA bio vezan. Osim toga, tim je promatrao kretanje NSP13 duž NA u prisutnosti inhibitora adenozin trifosfataze (ATPaze) ATPγS.

Rezultati studije

Istraživači su zabilježili 2413 pojedinačnih događaja translokacije i odmotavanja NSP13 i 27641 koraka helikaze. Rezultati studije potvrdili su da se NSP13 translocirao duž ssDNA i odmotao DNA duplekse brzinom od približno 100 parova baza u sekundi. Brzina translokacije NSP13 ovisila je o ATP-u, s maksimalnom brzinom reakcije (Vmax) između 600 i 3000 s-1 i Michaelisovom konstantom (Km) između 100 i 700 µM za ATP, ovisno o kontekstu slijeda unutar NSP13. Tako velike razlike u stopama translokacije na različitim položajima DNA upućuju na to da je identitet baze NA utjecao na kinetiku translokacije NSP13.

Rezultati studije također su pokazali da je kompleks NSP13-DNA manje stabilan i da ga je lakše rastaviti silom. Variranje potporne sile od ~24 PicoNewtona (pN) do ~44 pN na zasićenom ATP-u nije uzrokovalo značajnu promjenu u prosječnoj brzini translokacije NSP13. Nadalje, ovo je sugeriralo da je translokacija NSP13 bila pretežno kretanje vođeno hidrolizom ATP-a.

Autori su također otkrili da su koraci za odmotavanje dupleksa dsDNA bili (u prosjeku) gotovo osam puta duži od onih za translokaciju ssDNA. Nadalje, odmotavanje dsDNA bilo je sporije od translokacije ssDNA, iako su njihova vremena zadržavanja bila u korelaciji. Sličan učinak primijećen je u drugoj studiji koja je ispitivala SF1A helikazu PcrA koristeći SPRNT. Zanimljivo je da RNA-ovisna RNA polimeraza (RdRp) SARS-CoV-2 i NSP13 tvori kompleks pri približno 170 nt/s na 37°C, slično onome što je opaženo kao brzina odmotavanja NSP13 sa SPRNT-om.

Nadalje, autori su otkrili da je ATPγS oslabio djelovanje NSP13 putem nekoliko različitih kinetičkih procesa. Međutim, prevladavajući mehanizam ovisio je o primjeni potporne sile. Iako ATPγS nije održiv kandidat za lijek za NSP13, pokazao je moć SPRNT-a u proučavanju mehanizama inhibicije helikaze. Identificirane su tri metode inhibicije NSP13:

i) smanjenje njegove procesivnosti,

ii) sprječavanje spajanja njegovih domena 1A i 2A nakon vezanja nukleotida i

iii) Usporavanje hidrolize ATPγS u usporedbi s ATP-om.

Zaključci

Sve u svemu, studija je istaknula SPRNT kao vrijedan i moćan alat za istraživanje uloge NSP13 unutar kompleksa replikacije i transkripcije (RTC) SARS-CoV-2. Metoda SPRNT također je pokazala superiornu sposobnost da olakša proučavanje kinetike translokacije NSP13 ili bilo koje helikaze, čak i u nedostatku dupleksa. Nadalje, eksperimenti SPRNT mogli bi olakšati proučavanje NSP13 na izvornim sekvencama SARS-CoV-2 kako bi se rasvijetlili specifični elementi sekvence visoko strukturiranog genoma SARS-CoV-2 i njihova uloga u regulaciji NSP13.

*Važna NAPOMENA:bioRxiv objavljuje preliminarna znanstvena izvješća koja nisu recenzirana i stoga se ne bi trebala smatrati uvjerljivima, namijenjena usmjeravanju kliničke prakse/ponašanja u vezi sa zdravljem, niti ih treba tretirati kao utvrđenu informaciju.

Referenca:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Sinduja K. Marx, Keith J. Mickolajczyk, Jonathan M. Craig, Christopher A. Thomas, Akira M. Pfeffer, Sarah J. Abell, Jessica D. Carrasco, Michaela C. Franzi, Jesse R. Huang, Hwanhee C. Kim, Henry D. Brinkerhoff, Tarun M. Kapoor, Jens H. Gundlach, Andrew H. Laszlo. (2022). Hemmung der SARS-CoV-2-Helikase mit Einzelnukleotidauflösung. bioRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.10.07.511351 https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.10.07.511351v1