Az új módszer nanopórusos csipeszeket használ a SARS-CoV-2 helikáz gátlásának elősegítésére egyetlen nukleotid felbontással

Az új módszer nanopórusos csipeszeket használ a SARS-CoV-2 helikáz gátlásának elősegítésére egyetlen nukleotid felbontással

Egy nemrégiben megjelent tanulmányban bioRxiv * Preprint szerver: A kutatók a súlyos akut légúti szindróma koronavírus 2 (SARS-CoV-2) nem strukturális fehérje 13 (NSP13) hatásmechanizmusát és gátlását nagy térbeli és időbeli felbontással szemléltették.

Studie: Hemmung der SARS-CoV-2-Helikase mit Einzelnukleotidauflösung. Bildnachweis: atdigit/Shutterstock

*Fontos MEGJEGYZÉS:A bioRxiv olyan előzetes tudományos jelentéseket tesz közzé, amelyek nem szakértői értékelések, ezért nem tekinthetők meggyőzőnek, a klinikai gyakorlat/egészségügyi viselkedés iránymutatására szolgálnak, vagy megalapozott információként kezelhetők.

háttér

Mind a 15 SARS-COV-2 NSP közül az NSP13, egy ribonukleinsav (RNS) helikáz kulcsfontosságú a replikációjához. Jelenleg azonban nincsenek jóváhagyott vírusellenes gyógyszerek, amelyek az NSP13-at célozzák. A SARS-CoV-2 szerkezeti fehérjéktől eltérően az nsp13 aminosavszekvenciája a koronavírusok (CoV) sok típusa (például a Middle East Respiratory Syndrome CoV) és a SARS-CoV-2 aggodalomra okot adó variánsok (VOC) közül az egyik legkonzerváltabb. beleértve az Omicront is. Összességében ez teszi az nsp13-at vonzó, széles spektrumú vírusellenes célponttá, amely képes leküzdeni a jövőbeni CoV-járványokat.

Szerkezeti és biokémiai vizsgálatok kimutatták, hogy az nsp13 egy szupercsalád 1B (SF1B) RNS-helikáz. Inchworm-mechanizmust használ az egyszálú (ss) nukleinsav (NA) szubsztrátok mentén történő transzlokációhoz, amelyen keresztül az nsp13 valószínűleg feltekercseli az NA duplexeket. Kis lépésmérete miatt az egymolekulás technikák nem tudták megfejteni azt a sebességet, amellyel az nsp13 mozog az NA szubsztrátja mentén. Az ilyen felbontás betekintést nyújthat abba, hogy a gátló molekulák hogyan befolyásolják hatásmódjukat.

A tanulmányról

A jelen tanulmányban a kutatók egymolekulájú pikométeres felbontású nanopórusos csipeszeket (SPRNT) fejlesztettek ki a SARS-CoV-2 nsp13 DNS-szálakon történő mozgásának lépéseinek mérésére. Emellett bemutatták, hogyan használható az SPRNT egy helikáz inhibitor hatásmechanizmusának meghatározására. A csapat egyetlen nanopórust tervezett Mycobacterium smegmatis porin A-ból (MspA) egy foszfolipid kettős rétegben. A membránra adott feszültség hatására ionáram áramlott át a nanopóruson, ami negatív töltésű NA-t vont át a póruson.

A nanopóruson belüli különböző NA bázisok egyedi ionáram blokkokat okoztak, amelyek dekódolhatók az NA szekvenciába. A befogott NA-szálhoz kötött helikáz megáll a pórus szélén, és meghúzza az NA-t, ami egymást követő ionáram-lépésekhez vezet. A csapat ezeket egyetlen nukleotidból álló lépésekre oldotta fel, szubmillszekundumos időskálákon, hogy megfigyelje a helikáz mozgását az NA mentén. Ezzel egyidejűleg meghatározták a helikázban lévő szubsztrát NA szekvenciáját.

Figyelemre méltó az is, hogy az SPRNT az alkalmazott feszültséggel arányos erőt fejtett ki az enzim/NA komplexre, ami támogatta vagy ellenállt az nsp13 mozgásának, attól függően, hogy a nanopórus NA melyik végéhez kötődött. Ezenkívül a csapat megfigyelte az NSP13 mozgását az NA-k mentén az adenozin-trifoszfatáz (ATPáz) inhibitor ATPγS jelenlétében.

Tanulmányi eredmények

A kutatók 2413 egyedi NSP13 transzlokációs és letekerődési eseményt és 27 641 helikáz lépést rögzítettek. A vizsgálati eredmények megerősítették, hogy az NSP13 az ssDNS és a feltekert DNS duplexek mentén körülbelül 100 bázispár másodpercenkénti sebességgel transzlokálódik. Az NSP13 transzlokációs sebessége ATP-függő volt, a maximális reakciósebesség (Vmax) 600 és 3000 s-1 között, a Michaelis-állandó (Km) pedig 100 és 700 µM között volt ATP esetében, az NSP13-on belüli mögöttes szekvencia-kontextustól függően. A transzlokációs sebességek ilyen nagy különbségei a különböző DNS-pozíciókban arra utaltak, hogy az NA bázisazonossága befolyásolta az NSP13 transzlokációs kinetikáját.

A vizsgálati eredmények azt is kimutatták, hogy az NSP13-DNS komplex kevésbé volt stabil, és könnyebb volt erővel szétszedni. A támasztóerő ~24 PicoNewtonról (pN) ~44pN-ra történő változtatása telített ATP mellett nem okozott jelentős változást az NSP13 átlagos transzlokációs sebességében. Ezenkívül ez arra utalt, hogy az NSP13 transzlokációja túlnyomórészt ATP hidrolízis által vezérelt mozgás volt.

A szerzők azt is megállapították, hogy a dsDNS duplex letekercselési lépései (átlagosan) csaknem nyolcszor hosszabbak voltak, mint az ssDNS transzlokációé. Ezenkívül a dsDNS letekeredése lassabb volt, mint az ssDNS transzlokációja, bár tartózkodási idejük korrelált. Hasonló hatást figyeltek meg egy másik vizsgálatban is, amelyben az SF1A helikáz PcrA-t vizsgálták SPRNT segítségével. Érdekes módon a SARS-CoV-2 és az NSP13 RNS-függő RNS-polimeráza (RdRp) körülbelül 170 nt/s-os komplexet alkot 37 °C-on, hasonlóan ahhoz, amit az NSP13 letekeredési sebességeként figyeltek meg az SPRNT-nél.

Ezenkívül a szerzők azt találták, hogy az ATPγS számos különböző kinetikai folyamaton keresztül károsította az NSP13 hatását. Az uralkodó mechanizmus azonban a támasztóerő alkalmazásától függött. Bár az ATPγS nem életképes gyógyszerjelölt az NSP13 számára, bebizonyította az SPRNT erejét a helikáz gátlási mechanizmusok tanulmányozásában. Az NSP13 gátlásának három módszerét azonosították:

i) folyamatképességének csökkentése,

ii) megakadályozza az 1A és 2A domének összekapcsolódását a nukleotid kötés után, és

iii) Az ATPγS hidrolízis lassulása az ATP-hez képest.

Következtetések

Összességében a tanulmány kiemelte, hogy az SPRNT értékes és hatékony eszköz az NSP13 szerepének vizsgálatára a SARS-CoV-2 replikációs és transzkripciós komplexumában (RTC). Az SPRNT módszer kiváló képességet mutatott az NSP13 transzlokáció vagy bármely helikáz kinetikájának tanulmányozására még duplex hiányában is. Ezenkívül az SPRNT-kísérletek megkönnyíthetik az NSP13 tanulmányozását natív SARS-CoV-2 szekvenciákon, hogy megvilágítsák a rendkívül strukturált SARS-CoV-2 genom specifikus szekvenciaelemeit és azok szerepét az NSP13 szabályozásában.

*Fontos MEGJEGYZÉS:A bioRxiv olyan előzetes tudományos jelentéseket tesz közzé, amelyek nem szakértői értékelések, ezért nem tekinthetők meggyőzőnek, a klinikai gyakorlat/egészségügyi viselkedés iránymutatására szolgálnak, vagy megalapozott információként kezelhetők.

Referencia:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Sinduja K. Marx, Keith J. Mickolajczyk, Jonathan M. Craig, Christopher A. Thomas, Akira M. Pfeffer, Sarah J. Abell, Jessica D. Carrasco, Michaela C. Franzi, Jesse R. Huang, Hwanhee C. Kim, Henry D. Brinkerhoff, Tarun M. Kapoor, Jens H. Gundlach, Andrew H. Laszlo. (2022). Hemmung der SARS-CoV-2-Helikase mit Einzelnukleotidauflösung. bioRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.10.07.511351 https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.10.07.511351v1