Naujasis metodas naudoja nanoporinius pincetus, kad palengvintų SARS-CoV-2 helikazės slopinimą esant vieno nukleotido skiriamajai gebai

Naujasis metodas naudoja nanoporinius pincetus, kad palengvintų SARS-CoV-2 helikazės slopinimą esant vieno nukleotido skiriamajai gebai

Neseniai paskelbtame tyrime bioRxiv * Išankstinio spausdinimo serveris: mokslininkai vizualizavo sunkaus ūminio respiracinio sindromo koronaviruso 2 (SARS-CoV-2) nestruktūrinio baltymo 13 (NSP13) veikimo ir slopinimo mechanizmą su didele erdvinio ir laiko skyra.

Studie: Hemmung der SARS-CoV-2-Helikase mit Einzelnukleotidauflösung. Bildnachweis: atdigit/Shutterstock

*Svarbi PASTABA:BioRxiv skelbia preliminarias mokslines ataskaitas, kurios nėra recenzuojamos, todėl neturėtų būti laikomos įtikinamais, skirtos vadovautis klinikine praktika / su sveikata susijusiu elgesiu arba laikomos nustatyta informacija.

fone

Iš visų 15 SARS-COV-2 NSP, NSP13, ribonukleino rūgšties (RNR) helikazė, yra labai svarbi jos replikacijai. Tačiau šiuo metu nėra patvirtintų antivirusinių vaistų, skirtų NSP13. Skirtingai nuo SARS-CoV-2 struktūrinių baltymų, nsp13 aminorūgščių seka yra viena iš labiausiai išsilaikiusių tarp daugelio koronavirusų (CoV) tipų (pvz., Artimųjų Rytų respiracinio sindromo CoV) ir SARS-CoV-2 susirūpinimą keliančių variantų (LOJ). įskaitant Omicron. Kartu tai daro nsp13 patraukliu plataus spektro antivirusiniu taikiniu, galinčiu kovoti su būsimais CoV protrūkiais.

Struktūriniai ir biocheminiai tyrimai parodė, kad nsp13 yra superšeimos 1B (SF1B) RNR helikazė. Jis naudoja inchworm mechanizmą, skirtą perkėlimui išilgai vienos grandinės (ss) nukleino rūgšties (NA) substratų, per kuriuos nsp13 greičiausiai išvynioja NA dupleksus. Dėl mažo žingsnio dydžio vienos molekulės metodai negalėjo iššifruoti greičio, kuriuo nsp13 juda išilgai savo NA substrato. Tokia rezoliucija galėtų padėti suprasti, kaip slopinančios molekulės veikia jų veikimo būdą.

Apie studiją

Šiame tyrime mokslininkai sukūrė vienos molekulės pikometro skiriamosios gebos nanoporinius pincetus (SPRNT), kad išmatuotų SARS-CoV-2 nsp13 judėjimo DNR grandinėse žingsnius. Be to, jie parodė, kaip SPRNT gali būti naudojamas helikazės inhibitoriaus veikimo mechanizmui nustatyti. Komanda sukūrė vieną Mycobacterium smegmatis porin A (MspA) nanoporą fosfolipidų dvigubame sluoksnyje. Šiai membranai pritaikyta įtampa sukėlė jonų srovės tekėjimą per nanoporą, traukdama per poras neigiamo krūvio NA.

Skirtingos NA bazės nanoporoje sukėlė unikalius joninės srovės blokus, kuriuos buvo galima iššifruoti į NA seką. Helikazė, prijungta prie užfiksuotos NA grandinės, sustoja prie porų krašto ir traukia NA, o tai veda į nuoseklius joninės srovės žingsnius. Grupė juos išsprendė į vieno nukleotido žingsnius submilisekundės laiko skalėmis, kad galėtų stebėti helikazės judėjimą išilgai NA. Tuo pačiu metu jie nustatė helikazės substrato NA seką.

Taip pat pažymėtina, kad SPRNT veikė jėgą, proporcingą fermento / NA komplekso įtampai, kuri palaikė arba priešinosi nsp13 judėjimui, priklausomai nuo to, prie kurio nanoporos NA galo buvo prijungta. Be to, komanda stebėjo NSP13 judėjimą išilgai NA, esant adenozino trifosfatazės (ATPazės) inhibitoriui ATPγS.

Studijų rezultatai

Tyrėjai užfiksavo 2 413 atskirų NSP13 perkėlimo ir išsivyniojimo įvykių bei 27 641 helikazės žingsnį. Tyrimo rezultatai patvirtino, kad NSP13 persikėlė išilgai ssDNR ir išvyniojo DNR dupleksus maždaug 100 bazinių porų per sekundę greičiu. NSP13 translokacijos greitis priklausė nuo ATP, o didžiausias reakcijos greitis (Vmax) buvo nuo 600 iki 3000 s-1, o Michaelio konstanta (Km) - nuo 100 iki 700 µM ATP, priklausomai nuo pagrindinės sekos konteksto NSP13. Tokie dideli translokacijos greičio skirtumai skirtingose ​​DNR padėtyse leido manyti, kad NA bazės tapatybė turėjo įtakos NSP13 translokacijos kinetikai.

Tyrimo rezultatai taip pat parodė, kad NSP13-DNR kompleksas buvo mažiau stabilus ir jį buvo lengviau suskaidyti jėga. Pakeitus atraminę jėgą nuo ~ 24 pikoniutonų (pN) iki ~ 44 pN esant prisotintam ATP, vidutinis NSP13 translokacijos greitis reikšmingai nepasikeitė. Be to, tai leido manyti, kad NSP13 perkėlimas daugiausia buvo ATP hidrolizės skatinamas judėjimas.

Autoriai taip pat nustatė, kad dsDNA dvipusio išvyniojimo veiksmai buvo (vidutiniškai) beveik aštuonis kartus ilgesni nei ssDNA perkėlimas. Be to, dsDNR išsivyniojimas buvo lėtesnis nei ssDNR perkėlimas, nors jų buvimo laikas buvo susijęs. Panašus poveikis buvo pastebėtas kitame tyrime, tiriant SF1A helikazę PcrA naudojant SPRNT. Įdomu tai, kad SARS-CoV-2 ir NSP13 nuo RNR priklausoma RNR polimerazė (RdRp) sudaro kompleksą, kurio greitis yra maždaug 170 nt/s 37 °C temperatūroje, panašų į tai, kas buvo pastebėta kaip NSP13 išsivyniojimo greitis naudojant SPRNT.

Be to, autoriai nustatė, kad ATPγS sumažino NSP13 veikimą keliais skirtingais kinetiniais procesais. Tačiau vyraujantis mechanizmas priklausė nuo atraminės jėgos taikymo. Nors ATPγS nėra perspektyvus kandidatas į NSP13, jis parodė SPRNT galią tiriant helikazės slopinimo mechanizmus. Buvo nustatyti trys NSP13 slopinimo būdai:

i) sumažinti jo procesiškumą,

ii) užkirsti kelią jo domenų 1A ir 2A susijungimui po nukleotidų surišimo ir

iii) ATPγS hidrolizės sulėtėjimas, palyginti su ATP.

Išvados

Apskritai tyrimas pabrėžė, kad SPRNT yra vertinga ir galinga priemonė tirti NSP13 vaidmenį SARS-CoV-2 replikacijos ir transkripcijos komplekse (RTC). SPRNT metodas taip pat parodė puikų gebėjimą palengvinti NSP13 translokacijos ar bet kokios helikazės kinetikos tyrimą, net jei nėra duplekso. Be to, SPRNT eksperimentai galėtų palengvinti NSP13 tyrimą su natūraliomis SARS-CoV-2 sekomis, kad atskleistų specifinius labai struktūrizuoto SARS-CoV-2 genomo sekos elementus ir jų vaidmenį NSP13 reguliavime.

*Svarbi PASTABA:BioRxiv skelbia preliminarias mokslines ataskaitas, kurios nėra recenzuojamos, todėl neturėtų būti laikomos įtikinamais, skirtos vadovautis klinikine praktika / su sveikata susijusiu elgesiu arba laikomos nustatyta informacija.

Nuoroda:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Sinduja K. Marx, Keith J. Mickolajczyk, Jonathan M. Craig, Christopher A. Thomas, Akira M. Pfeffer, Sarah J. Abell, Jessica D. Carrasco, Michaela C. Franzi, Jesse R. Huang, Hwanhee C. Kim, Henry D. Brinkerhoff, Tarun M. Kapoor, Jens H. Gundlach, Andrew H. Laszlo. (2022). Hemmung der SARS-CoV-2-Helikase mit Einzelnukleotidauflösung. bioRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.10.07.511351 https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.10.07.511351v1