Ny metode bruker nanopore pinsett for å lette hemming av SARS-CoV-2-helikase ved enkeltnukleotidoppløsning

Ny metode bruker nanopore pinsett for å lette hemming av SARS-CoV-2-helikase ved enkeltnukleotidoppløsning

I en fersk studie publisert i bioRxiv * Preprint-server: Forskere visualiserte virkningsmekanismen og hemmingen av ikke-strukturelt protein 13 (NSP13) av alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) med høy spatiotemporal oppløsning.

Studie: Hemmung der SARS-CoV-2-Helikase mit Einzelnukleotidauflösung. Bildnachweis: atdigit/Shutterstock

*Viktig MERK:bioRxiv publiserer foreløpige vitenskapelige rapporter som ikke er fagfellevurdert og derfor ikke bør anses som avgjørende, ment å veilede klinisk praksis/helserelatert atferd, eller behandles som etablert informasjon.

bakgrunn

Av alle 15 SARS-COV-2 NSPer, er NSP13, en ribonukleinsyre (RNA) helikase, avgjørende for replikasjonen. Imidlertid er det foreløpig ingen godkjente antivirale legemidler som retter seg mot NSP13. I motsetning til SARS-CoV-2 strukturelle proteiner, er aminosyresekvensen til nsp13 en av de mest bevarte blant mange typer koronavirus (CoV) (f.eks. Midtøsten Respiratory Syndrome CoV) og SARS-CoV-2 varianter av bekymring (VOC). inkludert Omicron. Til sammen gjør dette nsp13 til et attraktivt bredspektret antiviralt mål med potensial til å bekjempe fremtidige CoV-utbrudd.

Strukturelle og biokjemiske studier har vist at nsp13 er en superfamilie 1B (SF1B) RNA-helikase. Den bruker en inchworm-mekanisme for translokasjon langs enkelttrådede (ss) nukleinsyresubstrater (NA), gjennom hvilke nsp13 sannsynligvis avvikler NA-duplekser. På grunn av sin lille trinnstørrelse, klarte ikke teknikker med enkeltmolekyler å dechiffrere hastigheten som nsp13 beveger seg langs NA-substratet. Slik oppløsning kan gi innsikt i hvordan hemmende molekyler påvirker deres virkemåte.

Om studiet

I den nåværende studien utviklet forskere enkeltmolekylepikometeroppløsnings nanopore pinsett (SPRNT) for å måle trinnene i SARS-CoV-2 nsp13-bevegelse på DNA-tråder. I tillegg viste de hvordan SPRNT kan brukes til å bestemme virkningsmekanismen til en helikasehemmer. Teamet designet en enkelt nanopore av Mycobacterium smegmatis porin A (MspA) i et fosfolipid-dobbeltlag. En spenning påført denne membranen førte til at en strøm av ioner strømmet gjennom nanoporen, og trakk negativt ladet NA gjennom poren.

Ulike NA-baser i nanoporen forårsaket unike ioniske strømblokker som kunne dekodes inn i NA-sekvensen. En helikase bundet til den fangede NA-strengen kommer til å hvile ved porekanten og trekker NA, noe som fører til påfølgende ionestrømtrinn. Teamet løste disse i enkeltnukleotid-trinn på submillisekunders tidsskalaer for å observere bevegelsen til helikasen langs NA. Samtidig bestemte de NA-sekvensen til substratet i helikasen.

Det er også bemerkelsesverdig at SPRNT utøvde en kraft proporsjonal med den påførte spenningen på enzym/NA-komplekset, som støttet eller motsto bevegelsen av nsp13, avhengig av hvilken ende av nanopore NA var bundet til. I tillegg observerte teamet bevegelsen av NSP13 langs NA-er i nærvær av adenosintrifosfatase (ATPase)-hemmeren ATPγS.

Studieresultater

Forskerne registrerte 2 413 individuelle NSP13-translokasjons- og avviklingshendelser og 27 641 helikase-trinn. Studieresultatene bekreftet at NSP13 translokerte langs ssDNA og avviklet DNA-duplekser med en hastighet på omtrent 100 basepar per sekund. NSP13-translokasjonshastigheten var ATP-avhengig, med maksimal reaksjonshastighet (Vmax) mellom 600 og 3000 s−1 og Michaelis-konstanten (Km) mellom 100 og 700 µM for ATP, avhengig av den underliggende sekvenskonteksten innenfor NSP13. Slike store forskjeller i translokasjonshastigheter ved forskjellige DNA-posisjoner antydet at NA-baseidentitet påvirket NSP13-translokasjonskinetikk.

Studieresultatene viste også at NSP13-DNA-komplekset var mindre stabilt og var lettere å bryte fra hverandre med kraft. Variasjon av støttekraften fra ~24 PicoNewtons (pN) til ~44 pN ved mettet ATP forårsaket ikke en signifikant endring i den gjennomsnittlige translokasjonshastigheten til NSP13. Videre antydet dette at NSP13-translokasjon hovedsakelig var en ATP-hydrolysedrevet bevegelse.

Forfatterne fant også at trinnene for å avvikle dsDNA-dupleksen var (i gjennomsnitt) nesten åtte ganger lengre enn de for ssDNA-translokasjon. Videre var avvikling av dsDNA langsommere enn translokasjon av ssDNA, selv om oppholdstidene deres var korrelert. En lignende effekt ble observert i en annen studie som undersøkte SF1A helicase PcrA ved bruk av SPRNT. Interessant nok danner den RNA-avhengige RNA-polymerasen (RdRp) av SARS-CoV-2 og NSP13 et kompleks ved omtrent 170 nt/s ved 37 °C, lik det som ble observert som NSP13-avviklingshastighet med SPRNT.

Videre fant forfatterne at ATPγS svekket virkningen av NSP13 via flere forskjellige kinetiske prosesser. Imidlertid var den dominerende mekanismen avhengig av bruken av støttekraft. Selv om ATPγS ikke er en levedyktig medikamentkandidat for NSP13, demonstrerte det kraften til SPRNT i å studere mekanismene for helikasehemming. Tre metoder for NSP13-hemming er identifisert:

i) redusere prosessiviteten,

ii) forhindrer sammenføyningen av dets domener 1A og 2A etter nukleotidbinding og

iii) Senking av ATPγS hydrolyse sammenlignet med ATP.

Konklusjoner

Samlet sett fremhevet studien SPRNT som et verdifullt og kraftig verktøy for å undersøke rollen til NSP13 innenfor replikasjons- og transkripsjonskomplekset (RTC) til SARS-CoV-2. SPRNT-metoden demonstrerte også en overlegen evne til å lette studiet av kinetikken til NSP13-translokasjon eller en hvilken som helst helikase, selv i fravær av en dupleks. Videre kan SPRNT-eksperimenter lette studiet av NSP13 på native SARS-CoV-2-sekvenser for å kaste lys over spesifikke sekvenselementer i det høyt strukturerte SARS-CoV-2-genomet og deres rolle i NSP13-regulering.

*Viktig MERK:bioRxiv publiserer foreløpige vitenskapelige rapporter som ikke er fagfellevurdert og derfor ikke bør anses som avgjørende, ment å veilede klinisk praksis/helserelatert atferd, eller behandles som etablert informasjon.

Referanse:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Sinduja K. Marx, Keith J. Mickolajczyk, Jonathan M. Craig, Christopher A. Thomas, Akira M. Pfeffer, Sarah J. Abell, Jessica D. Carrasco, Michaela C. Franzi, Jesse R. Huang, Hwanhee C. Kim, Henry D. Brinkerhoff, Tarun M. Kapoor, Jens H. Gundlach, Andrew H. Laszlo. (2022). Hemmung der SARS-CoV-2-Helikase mit Einzelnukleotidauflösung. bioRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.10.07.511351 https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.10.07.511351v1