Nowatorska metoda wykorzystuje pęsety z nanoporami, aby ułatwić hamowanie helikazy SARS-CoV-2 przy rozdzielczości pojedynczego nukleotydu

Nowatorska metoda wykorzystuje pęsety z nanoporami, aby ułatwić hamowanie helikazy SARS-CoV-2 przy rozdzielczości pojedynczego nukleotydu

W niedawnym badaniu opublikowanym w bioRxiv * Serwer wydruku wstępnego: Naukowcy wizualizowali mechanizm działania i hamowania niestrukturalnego białka 13 (NSP13) wirusa 2 ciężkiego ostrego zespołu oddechowego (SARS-CoV-2) z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną.

Studie: Hemmung der SARS-CoV-2-Helikase mit Einzelnukleotidauflösung. Bildnachweis: atdigit/Shutterstock

*Ważna UWAGA:bioRxiv publikuje wstępne raporty naukowe, które nie są recenzowane i dlatego nie należy ich uważać za rozstrzygające, mające na celu wytyczne dla praktyki klinicznej/zachowań związanych ze zdrowiem lub traktowane jako ustalone informacje.

tło

Ze wszystkich 15 NSP SARS-COV-2, NSP13, helikaza kwasu rybonukleinowego (RNA), ma kluczowe znaczenie dla jego replikacji. Jednakże obecnie nie ma zatwierdzonych leków przeciwwirusowych ukierunkowanych na NSP13. W przeciwieństwie do białek strukturalnych SARS-CoV-2, sekwencja aminokwasów nsp13 jest jedną z najbardziej konserwatywnych spośród wielu typów koronawirusów (CoV) (np. bliskowschodniego zespołu oddechowego CoV) i budzących obawy wariantów SARS-CoV-2 (LZO). w tym Omicron. Podsumowując, sprawia to, że nsp13 jest atrakcyjnym celem przeciwwirusowym o szerokim spektrum działania i może potencjalnie zwalczać przyszłe epidemie CoV.

Badania strukturalne i biochemiczne wykazały, że nsp13 jest helikazą RNA z nadrodziny 1B (SF1B). Wykorzystuje mechanizm robaka inchworm do translokacji wzdłuż jednoniciowych (ss) substratów kwasu nukleinowego (NA), dzięki któremu nsp13 prawdopodobnie rozwija dupleksy NA. Ze względu na mały rozmiar kroku techniki jednocząsteczkowe nie były w stanie rozszyfrować prędkości, z jaką nsp13 przemieszcza się wzdłuż substratu NA. Takie rozwiązanie mogłoby zapewnić wgląd w to, jak cząsteczki hamujące wpływają na ich sposób działania.

O badaniu

W ramach niniejszego badania naukowcy opracowali jednocząsteczkowe pęsety nanoporowe o rozdzielczości pikometrycznej (SPRNT) do pomiaru etapów ruchu nsp13 wirusa SARS-CoV-2 na niciach DNA. Ponadto pokazali, w jaki sposób można zastosować SPRNT do określenia mechanizmu działania inhibitora helikazy. Zespół zaprojektował pojedynczy nanopor Mycobacterium smegmatis porin A (MspA) w dwuwarstwie fosfolipidowej. Napięcie przyłożone do tej membrany spowodowało przepływ prądu jonów przez nanopor, wciągając ujemnie naładowany NA przez pory.

Różne zasady NA w nanoporach spowodowały powstanie unikalnych bloków prądu jonowego, które można było zdekodować w sekwencję NA. Helikaza związana z wychwyconą nicią NA zatrzymuje się na krawędzi poru i przyciąga NA, prowadząc do kolejnych etapów prądu jonowego. Zespół rozdzielił je na etapy składające się z pojedynczych nukleotydów w submilisekundowych skalach czasu, aby obserwować ruch helikazy wzdłuż NA. Jednocześnie określili sekwencję NA substratu w helikazie.

Warto również zauważyć, że SPRNT wywierał siłę proporcjonalną do przyłożonego napięcia na kompleks enzym/NA, który wspierał lub przeciwstawiał się ruchowi nsp13, w zależności od tego, do którego końca nanoporu NA był związany. Ponadto zespół zaobserwował ruch NSP13 wzdłuż NA w obecności inhibitora trifosfatazy adenozyny (ATPazy) ATPγS.

Wyniki badań

Naukowcy zarejestrowali 2413 pojedynczych zdarzeń translokacji i rozwijania NSP13 oraz 27 641 etapów helikazy. Wyniki badania potwierdziły, że NSP13 ulegał translokacji wzdłuż ssDNA i rozwijanych dupleksów DNA z szybkością około 100 par zasad na sekundę. Szybkość translokacji NSP13 była zależna od ATP, z maksymalną szybkością reakcji (Vmax) pomiędzy 600 a 3000 s-1 i stałą Michaelisa (Km) pomiędzy 100 a 700 µM dla ATP, w zależności od podstawowego kontekstu sekwencji w NSP13. Tak duże różnice w szybkościach translokacji w różnych pozycjach DNA sugerują, że tożsamość zasad NA wpływa na kinetykę translokacji NSP13.

Wyniki badania wykazały również, że kompleks NSP13-DNA był mniej stabilny i łatwiej było go rozerwać przy użyciu siły. Zmiana siły nośnej od ~24 pikoniutonów (pN) do ~44 pN przy nasyconym ATP nie spowodowała znaczącej zmiany w średnim tempie translokacji NSP13. Co więcej, sugeruje to, że translokacja NSP13 była głównie ruchem napędzanym hydrolizą ATP.

Autorzy odkryli również, że etapy rozwijania dupleksu dsDNA były (średnio) prawie osiem razy dłuższe niż etapy translokacji ssDNA. Co więcej, rozwijanie dsDNA było wolniejsze niż translokacja ssDNA, chociaż czasy ich przebywania były skorelowane. Podobny efekt zaobserwowano w innym badaniu oceniającym helikazę SF1A PcrA przy użyciu SPRNT. Co ciekawe, zależna od RNA polimeraza RNA (RdRp) SARS-CoV-2 i NSP13 tworzy kompleks przy około 170 nt/s w temperaturze 37°C, podobnie do tej, którą zaobserwowano jako prędkość odwijania NSP13 za pomocą SPRNT.

Co więcej, autorzy odkryli, że ATPγS zaburza działanie NSP13 poprzez kilka różnych procesów kinetycznych. Dominujący mechanizm polegał jednak na przyłożeniu siły podporowej. Chociaż ATPγS nie jest realnym kandydatem na lek dla NSP13, wykazał moc SPRNT w badaniu mechanizmów hamowania helikazy. Zidentyfikowano trzy metody hamowania NSP13:

i) zmniejszenie jego procesywności,

ii) zapobieganie łączeniu się jego domen 1A i 2A po związaniu nukleotydu i

iii) Spowolnienie hydrolizy ATPγS w porównaniu z ATP.

Wnioski

Ogólnie rzecz biorąc, w badaniu podkreślono, że SPRNT jest cennym i potężnym narzędziem do badania roli NSP13 w kompleksie replikacji i transkrypcji (RTC) SARS-CoV-2. Metoda SPRNT wykazała także doskonałą zdolność do ułatwiania badania kinetyki translokacji NSP13 lub dowolnej helikazy, nawet w przypadku braku dupleksu. Ponadto eksperymenty SPRNT mogą ułatwić badanie NSP13 na natywnych sekwencjach SARS-CoV-2, aby rzucić światło na określone elementy sekwencji wysoce ustrukturyzowanego genomu SARS-CoV-2 i ich rolę w regulacji NSP13.

*Ważna UWAGA:bioRxiv publikuje wstępne raporty naukowe, które nie są recenzowane i dlatego nie należy ich uważać za rozstrzygające, mające na celu wytyczne dla praktyki klinicznej/zachowań związanych ze zdrowiem lub traktowane jako ustalone informacje.

Odniesienie:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Sinduja K. Marx, Keith J. Mickolajczyk, Jonathan M. Craig, Christopher A. Thomas, Akira M. Pfeffer, Sarah J. Abell, Jessica D. Carrasco, Michaela C. Franzi, Jesse R. Huang, Hwanhee C. Kim, Henry D. Brinkerhoff, Tarun M. Kapoor, Jens H. Gundlach, Andrew H. Laszlo. (2022). Hemmung der SARS-CoV-2-Helikase mit Einzelnukleotidauflösung. bioRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.10.07.511351 https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.10.07.511351v1