Metoda nouă folosește pensete nanopore pentru a facilita inhibarea helicazei SARS-CoV-2 la rezoluția unui singur nucleotid

Metoda nouă folosește pensete nanopore pentru a facilita inhibarea helicazei SARS-CoV-2 la rezoluția unui singur nucleotid

Într-un studiu recent publicat în bioRxiv * Server de preprint: Cercetătorii au vizualizat mecanismul de acțiune și inhibarea proteinei nestructurale 13 (NSP13) a sindromului respirator acut sever coronavirus 2 (SARS-CoV-2) cu rezoluție spațio-temporală mare.

Studie: Hemmung der SARS-CoV-2-Helikase mit Einzelnukleotidauflösung. Bildnachweis: atdigit/Shutterstock

*NOTA importanta:bioRxiv publică rapoarte științifice preliminare care nu sunt revizuite de către colegi și, prin urmare, nu trebuie considerate concludente, menite să ghideze practica clinică/comportamentul legat de sănătate sau tratate ca informații stabilite.

fundal

Dintre toate cele 15 NSP SARS-COV-2, NSP13, o helicază a acidului ribonucleic (ARN), este crucială pentru replicarea sa. Cu toate acestea, în prezent nu există medicamente antivirale aprobate care vizează NSP13. Spre deosebire de proteinele structurale SARS-CoV-2, secvența de aminoacizi a nsp13 este una dintre cele mai conservate dintre multe tipuri de coronavirus (CoV) (de exemplu, Sindromul respirator din Orientul Mijlociu CoV) și variantele de îngrijorare SARS-CoV-2 (COV). inclusiv Omicron. Luat împreună, acest lucru face din nsp13 o țintă antivirală atractivă cu spectru larg, cu potențialul de a combate viitoarele focare de CoV.

Studiile structurale și biochimice au arătat că nsp13 este o superfamilie 1B (SF1B) ARN helicaza. Utilizează un mecanism de vierme inch pentru translocare de-a lungul substraturilor de acid nucleic (NA) monocatenar (ss), prin care nsp13 probabil desface duplexurile NA. Datorită dimensiunii sale mici, tehnicile cu o singură moleculă nu au putut descifra viteza cu care nsp13 se mișcă de-a lungul substratului său NA. O astfel de rezoluție ar putea oferi o perspectivă asupra modului în care moleculele inhibitoare le influențează modul de acțiune.

Despre studiu

În studiul de față, cercetătorii au dezvoltat pensete nanopore cu rezoluție picometru cu o singură moleculă (SPRNT) pentru a măsura pașii mișcării SARS-CoV-2 nsp13 pe firele de ADN. În plus, au arătat cum SPRNT poate fi utilizat pentru a determina mecanismul de acțiune al unui inhibitor de helicază. Echipa a proiectat un singur nanopor de Mycobacterium smegmatis porin A (MspA) într-un strat dublu de fosfolipide. O tensiune aplicată acestei membrane a făcut ca un curent de ioni să curgă prin nanopor, atragând NA încărcat negativ prin por.

Diferitele baze NA din nanopor au provocat blocuri unice de curent ionic care ar putea fi decodificate în secvența NA. O helicază legată de firul NA capturat se oprește la marginea porilor și trage NA, ducând la pași succesivi de curent ionic. Echipa le-a rezolvat în pași cu o singură nucleotidă la scale de timp submilisecunde pentru a observa mișcarea helicazei de-a lungul NA. În același timp, au determinat secvența NA a substratului în helicază.

De asemenea, este de remarcat faptul că SPRNT a exercitat o forță proporțională cu tensiunea aplicată asupra complexului enzimă/NA, care a susținut sau a rezistat mișcării nsp13, în funcție de capătul la care a fost legat NA nanoporului. În plus, echipa a observat mișcarea NSP13 de-a lungul NA în prezența inhibitorului de adenozin trifosfatază (ATPază) ATPγS.

Rezultatele studiului

Cercetătorii au înregistrat 2.413 evenimente individuale de translocare și derulare a NSP13 și 27.641 de pași de helicază. Rezultatele studiului au confirmat că NSP13 s-a translocat de-a lungul ssADN și a duplexurilor de ADN desfășurate la o rată de aproximativ 100 de perechi de baze pe secundă. Rata de translocare a NSP13 a fost dependentă de ATP, cu viteza maximă de reacție (Vmax) între 600 și 3000 s-1 și constanta Michaelis (Km) între 100 și 700 µM pentru ATP, în funcție de contextul secvenței subiacente din NSP13. Diferențele atât de mari în ratele de translocare la diferite poziții ADN au sugerat că identitatea bazei NA a influențat cinetica de translocare a NSP13.

Rezultatele studiului au arătat, de asemenea, că complexul NSP13-ADN a fost mai puțin stabil și a fost mai ușor de spart cu forță. Varierea forței de susținere de la ~ 24 PicoNewtoni (pN) la ~ 44 pN la ATP saturat nu a provocat o schimbare semnificativă a ratei medii de translocare a NSP13. În plus, acest lucru a sugerat că translocarea NSP13 a fost în principal o mișcare condusă de hidroliză ATP.

Autorii au descoperit, de asemenea, că pașii pentru derularea duplexului dsDNA au fost (în medie) de aproape opt ori mai lungi decât cei pentru translocarea ssDNA. Mai mult, derularea dsDNA a fost mai lentă decât translocarea ssDNA, deși timpii lor de rezidență au fost corelați. Un efect similar a fost observat într-un alt studiu care examinează helicaza SF1A PcrA folosind SPRNT. Interesant este că ARN polimeraza dependentă de ARN (RdRp) a SARS-CoV-2 și NSP13 formează un complex la aproximativ 170 nt/s la 37 ° C, similar cu ceea ce a fost observat ca viteza de desfășurare a NSP13 cu SPRNT.

În plus, autorii au descoperit că ATPγS a afectat acțiunea NSP13 prin mai multe procese cinetice diferite. Cu toate acestea, mecanismul predominant depindea de aplicarea forței de susținere. Deși ATPγS nu este un medicament candidat viabil pentru NSP13, a demonstrat puterea SPRNT în studierea mecanismelor de inhibare a helicazei. Au fost identificate trei metode de inhibare a NSP13:

i) reducerea procesivității sale,

ii) prevenirea unirii domeniilor sale 1A și 2A după legarea nucleotidelor și

iii) Încetinirea hidrolizei ATPγS în comparație cu ATP.

Concluzii

În general, studiul a evidențiat SPRNT ca un instrument valoros și puternic pentru a investiga rolul NSP13 în complexul de replicare și transcripție (RTC) al SARS-CoV-2. Metoda SPRNT a demonstrat, de asemenea, o capacitate superioară de a facilita studiul cineticii translocației NSP13 sau a oricărei helicaze, chiar și în absența unui duplex. Mai mult, experimentele SPRNT ar putea facilita studiul NSP13 pe secvențele native SARS-CoV-2 pentru a face lumină asupra elementelor de secvență specifice ale genomului SARS-CoV-2 foarte structurat și rolul lor în reglementarea NSP13.

*NOTA importanta:bioRxiv publică rapoarte științifice preliminare care nu sunt revizuite de către colegi și, prin urmare, nu trebuie considerate concludente, menite să ghideze practica clinică/comportamentul legat de sănătate sau tratate ca informații stabilite.

Referinţă:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Sinduja K. Marx, Keith J. Mickolajczyk, Jonathan M. Craig, Christopher A. Thomas, Akira M. Pfeffer, Sarah J. Abell, Jessica D. Carrasco, Michaela C. Franzi, Jesse R. Huang, Hwanhee C. Kim, Henry D. Brinkerhoff, Tarun M. Kapoor, Jens H. Gundlach, Andrew H. Laszlo. (2022). Hemmung der SARS-CoV-2-Helikase mit Einzelnukleotidauflösung. bioRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.10.07.511351 https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.10.07.511351v1