Nová metóda využíva nanopórové pinzety na uľahčenie inhibície SARS-CoV-2 helikázy pri rozlíšení jedného nukleotidu

Nová metóda využíva nanopórové pinzety na uľahčenie inhibície SARS-CoV-2 helikázy pri rozlíšení jedného nukleotidu

V nedávnej štúdii publikovanej v bioRxiv * Predtlačový server: Výskumníci vizualizovali mechanizmus účinku a inhibíciu neštrukturálneho proteínu 13 (NSP13) koronavírusu ťažkého akútneho respiračného syndrómu 2 (SARS-CoV-2) s vysokým časopriestorovým rozlíšením.

Studie: Hemmung der SARS-CoV-2-Helikase mit Einzelnukleotidauflösung. Bildnachweis: atdigit/Shutterstock

*Dôležitá POZNÁMKA:bioRxiv publikuje predbežné vedecké správy, ktoré nie sú recenzované odborníkmi, a preto by sa nemali považovať za presvedčivé, určené na usmernenie klinickej praxe/správania súvisiaceho so zdravím, alebo by sa s nimi nemalo zaobchádzať ako s overenými informáciami.

pozadia

Zo všetkých 15 SARS-COV-2 NSP je pre jeho replikáciu rozhodujúca NSP13, helikáza ribonukleovej kyseliny (RNA). V súčasnosti však neexistujú žiadne schválené antivírusové lieky zamerané na NSP13. Na rozdiel od štrukturálnych proteínov SARS-CoV-2 je aminokyselinová sekvencia nsp13 jednou z najkonzervovanejších spomedzi mnohých typov koronavírusov (CoV) (napr. blízkovýchodný respiračný syndróm CoV) a obávané varianty SARS-CoV-2 (VOC). vrátane Omicron. Celkovo to robí z nsp13 atraktívny širokospektrálny antivírusový cieľ s potenciálom bojovať proti budúcim prepuknutiam CoV.

Štrukturálne a biochemické štúdie ukázali, že nsp13 je superrodina 1B (SF1B) RNA helikáza. Využíva mechanizmus inchworm na translokáciu pozdĺž jednovláknových (ss) substrátov nukleovej kyseliny (NA), cez ktoré nsp13 pravdepodobne odvíja NA duplexy. Kvôli svojej malej veľkosti kroku neboli techniky s jednou molekulou schopné dešifrovať rýchlosť, ktorou sa nsp13 pohybuje pozdĺž svojho substrátu NA. Takéto rozlíšenie by mohlo poskytnúť pohľad na to, ako inhibičné molekuly ovplyvňujú ich spôsob účinku.

O štúdiu

V tejto štúdii výskumníci vyvinuli pinzetu s nanopórovým rozlíšením s jednou molekulou (SPRNT) na meranie krokov pohybu SARS-CoV-2 nsp13 na vláknach DNA. Okrem toho ukázali, ako sa dá SPRNT použiť na určenie mechanizmu účinku inhibítora helikázy. Tím navrhol jeden nanopór Mycobacterium smegmatis porin A (MspA) vo fosfolipidovej dvojvrstve. Napätie aplikované na túto membránu spôsobilo, že prúd iónov preteká cez nanopóry a ťahá záporne nabitý NA cez pór.

Rôzne NA bázy v nanopóroch spôsobili jedinečné bloky iónového prúdu, ktoré bolo možné dekódovať do sekvencie NA. Helikáza naviazaná na zachytené vlákno NA sa zastaví na okraji pórov a stiahne NA, čo vedie k postupným krokom iónového prúdu. Tím ich rozdelil na jednonukleotidové kroky na submilisekundových časových mierkach, aby pozoroval pohyb helikázy pozdĺž NA. Zároveň určili NA sekvenciu substrátu v helikáze.

Je tiež pozoruhodné, že SPRNT vyvíjal silu úmernú aplikovanému napätiu na komplex enzým / NA, ktorý podporoval alebo odolával pohybu nsp13 v závislosti od toho, na ktorý koniec nanopóru NA bol viazaný. Okrem toho tím pozoroval pohyb NSP13 pozdĺž NA v prítomnosti inhibítora adenozíntrifosfatázy (ATPázy) ATPyS.

Výsledky štúdie

Výskumníci zaznamenali 2 413 jednotlivých udalostí translokácie a odvíjania NSP13 a 27 641 krokov helikázy. Výsledky štúdie potvrdili, že NSP13 sa translokoval pozdĺž ssDNA a odvinutých DNA duplexov rýchlosťou približne 100 párov báz za sekundu. Rýchlosť translokácie NSP13 bola závislá od ATP, s maximálnou reakčnou rýchlosťou (Vmax) medzi 600 a 3000 s-1 a Michaelisovou konštantou (Km) medzi 100 a 700 uM pre ATP, v závislosti od kontextu základnej sekvencie v rámci NSP13. Takéto veľké rozdiely v rýchlosti translokácie v rôznych polohách DNA naznačujú, že identita bázy NA ovplyvnila kinetiku translokácie NSP13.

Výsledky štúdie tiež ukázali, že komplex NSP13-DNA bol menej stabilný a bolo ľahšie ho rozbiť silou. Zmena podpornej sily od ~ 24 PicoNewtonov (pN) do ~ 44 pN pri nasýtenom ATP nespôsobila významnú zmenu v priemernej rýchlosti translokácie NSP13. Ďalej to naznačuje, že translokácia NSP13 bola prevažne pohybom poháňaným hydrolýzou ATP.

Autori tiež zistili, že kroky na uvoľnenie duplexu dsDNA boli (v priemere) takmer osemkrát dlhšie ako kroky na translokáciu ssDNA. Okrem toho odvíjanie dsDNA bolo pomalšie ako translokácia ssDNA, hoci ich doby zotrvania boli korelované. Podobný účinok sa pozoroval v inej štúdii skúmajúcej helikázový PcrA SF1A pomocou SPRNT. Je zaujímavé, že RNA-dependentná RNA polymeráza (RdRp) SARS-CoV-2 a NSP13 tvorí komplex pri približne 170 nt/s pri 37 °C, podobne ako to, čo sa pozorovalo pri rýchlosti odvíjania NSP13 pri SPRNT.

Okrem toho autori zistili, že ATPyS narušil účinok NSP13 prostredníctvom niekoľkých rôznych kinetických procesov. Prevládajúci mechanizmus však závisel od použitia podpornej sily. Aj keď ATPyS nie je životaschopným kandidátom na liečivo pre NSP13, preukázala silu SPRNT pri štúdiu mechanizmov inhibície helikázy. Boli identifikované tri spôsoby inhibície NSP13:

i) zníženie jeho spracovateľnosti,

ii) zabránenie spojenia jeho domén 1A a 2A po nukleotidovej väzbe a

iii) Spomalenie hydrolýzy ATPyS v porovnaní s ATP.

Závery

Celkovo štúdia zdôraznila SPRNT ako cenný a výkonný nástroj na skúmanie úlohy NSP13 v rámci replikačného a transkripčného komplexu (RTC) SARS-CoV-2. Metóda SPRNT tiež preukázala vynikajúcu schopnosť uľahčiť štúdium kinetiky translokácie NSP13 alebo akejkoľvek helikázy, a to aj v neprítomnosti duplexu. Okrem toho by experimenty SPRNT mohli uľahčiť štúdium NSP13 na natívnych sekvenciách SARS-CoV-2, aby sa objasnili špecifické sekvenčné prvky vysoko štruktúrovaného genómu SARS-CoV-2 a ich úloha v regulácii NSP13.

*Dôležitá POZNÁMKA:bioRxiv publikuje predbežné vedecké správy, ktoré nie sú recenzované odborníkmi, a preto by sa nemali považovať za presvedčivé, určené na usmernenie klinickej praxe/správania súvisiaceho so zdravím, alebo by sa s nimi nemalo zaobchádzať ako s overenými informáciami.

Referencia:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Sinduja K. Marx, Keith J. Mickolajczyk, Jonathan M. Craig, Christopher A. Thomas, Akira M. Pfeffer, Sarah J. Abell, Jessica D. Carrasco, Michaela C. Franzi, Jesse R. Huang, Hwanhee C. Kim, Henry D. Brinkerhoff, Tarun M. Kapoor, Jens H. Gundlach, Andrew H. Laszlo. (2022). Hemmung der SARS-CoV-2-Helikase mit Einzelnukleotidauflösung. bioRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.10.07.511351 https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.10.07.511351v1