Nova metoda uporablja pinceto z nanoporami za lažjo inhibicijo helikaze SARS-CoV-2 pri ločljivosti enega nukleotida

Nova metoda uporablja pinceto z nanoporami za lažjo inhibicijo helikaze SARS-CoV-2 pri ločljivosti enega nukleotida

V nedavni študiji, objavljeni v bioRxiv * Strežnik prednatisa: Raziskovalci so vizualizirali mehanizem delovanja in inhibicijo nestrukturnega proteina 13 (NSP13) koronavirusa 2 hudega akutnega respiratornega sindroma (SARS-CoV-2) z visoko prostorsko-časovno ločljivostjo.

Studie: Hemmung der SARS-CoV-2-Helikase mit Einzelnukleotidauflösung. Bildnachweis: atdigit/Shutterstock

*Pomembna OPOMBA:bioRxiv objavlja predhodna znanstvena poročila, ki niso strokovno pregledana in se zato ne bi smela šteti za dokončna, namenjena usmerjanju klinične prakse/vedenja v zvezi z zdravjem ali jih obravnavati kot uveljavljene informacije.

ozadje

Od vseh 15 SARS-COV-2 NSP je NSP13, helikaza ribonukleinske kisline (RNA), ključnega pomena za njegovo razmnoževanje. Vendar pa trenutno ni odobrenih protivirusnih zdravil, ki bi ciljala na NSP13. Za razliko od strukturnih proteinov SARS-CoV-2 je aminokislinsko zaporedje nsp13 eno najbolj ohranjenih med številnimi vrstami koronavirusov (CoV) (npr. bližnjevzhodni respiratorni sindrom CoV) in skrb vzbujajočimi različicami SARS-CoV-2 (VOC). vključno z omikronom. Skupaj je zaradi tega nsp13 privlačna protivirusna tarča širokega spektra s potencialom za boj proti prihodnjim izbruhom CoV.

Strukturne in biokemične študije so pokazale, da je nsp13 RNA helikaza superdružine 1B (SF1B). Uporablja mehanizem inchworm za translokacijo vzdolž substratov enoverižne (ss) nukleinske kisline (NA), skozi katere nsp13 verjetno odvija duplekse NA. Zaradi majhne velikosti koraka tehnike z eno molekulo niso mogle dešifrirati hitrosti, s katero se nsp13 premika vzdolž substrata NA. Takšna ločljivost bi lahko zagotovila vpogled v to, kako zaviralne molekule vplivajo na njihov način delovanja.

O študiju

V tej študiji so raziskovalci razvili enomolekulsko pikometrsko ločljivost nanoporne pincete (SPRNT) za merjenje korakov gibanja SARS-CoV-2 nsp13 na verigah DNK. Poleg tega so pokazali, kako lahko SPRNT uporabimo za določitev mehanizma delovanja zaviralca helikaze. Ekipa je oblikovala eno samo nanoporo Mycobacterium smegmatis porina A (MspA) znotraj fosfolipidnega dvosloja. Napetost, uporabljena na tej membrani, je povzročila tok ionov, ki je stekel skozi nanopore in potegnil negativno nabite NA skozi pore.

Različne baze NA znotraj nanopore so povzročile edinstvene bloke ionskega toka, ki jih je bilo mogoče dekodirati v zaporedje NA. Helikaza, vezana na zajeto verigo NA, se ustavi na robu pore in potegne NA, kar vodi do zaporednih korakov ionskega toka. Ekipa jih je razdelila v enonukleotidne korake na submilisekundnih časovnih skalah, da bi opazovala gibanje helikaze vzdolž NA. Hkrati so določili zaporedje NA substrata v helikazi.

Omeniti velja tudi, da je SPRNT izvajal silo, sorazmerno z uporabljeno napetostjo na kompleksu encim/NA, ki je podpiral ali upiral gibanje nsp13, odvisno od tega, na kateri konec nanopore NA je bil vezan. Poleg tega je ekipa opazila gibanje NSP13 vzdolž NA v prisotnosti zaviralca adenozin trifosfataze (ATPaze) ATPγS.

Rezultati študije

Raziskovalci so zabeležili 2.413 posameznih dogodkov translokacije in odvijanja NSP13 ter 27.641 korakov helikaze. Rezultati študije so potrdili, da se je NSP13 translociral vzdolž ssDNA in odvil duplekse DNA s hitrostjo približno 100 baznih parov na sekundo. Hitrost translokacije NSP13 je bila odvisna od ATP, z največjo hitrostjo reakcije (Vmax) med 600 in 3000 s-1 in Michaelisovo konstanto (Km) med 100 in 700 µM za ATP, odvisno od konteksta osnovne sekvence znotraj NSP13. Tako velike razlike v stopnjah translokacije na različnih položajih DNA kažejo, da je identiteta baze NA vplivala na kinetiko translokacije NSP13.

Rezultati študije so tudi pokazali, da je kompleks NSP13-DNA manj stabilen in ga je lažje razbiti s silo. Spreminjanje podporne sile od ~24 PicoNewtonov (pN) do ~44 pN pri nasičenem ATP ni povzročilo bistvene spremembe v povprečni hitrosti translokacije NSP13. Poleg tega je to nakazovalo, da je bila translokacija NSP13 pretežno gibanje, ki ga poganja hidroliza ATP.

Avtorji so tudi ugotovili, da so bili koraki za odvijanje dupleksa dsDNA (povprečno) skoraj osemkrat daljši od tistih za translokacijo ssDNA. Poleg tega je bilo odvijanje dsDNA počasnejše od translokacije ssDNA, čeprav so bili njihovi časi zadrževanja povezani. Podoben učinek so opazili v drugi študiji, ki je proučevala helikazo SF1A PcrA z uporabo SPRNT. Zanimivo je, da RNA-odvisna RNA-polimeraza (RdRp) SARS-CoV-2 in NSP13 tvori kompleks pri približno 170 nt/s pri 37 °C, podobno kot je bilo opaženo kot hitrost odvijanja NSP13 s SPRNT.

Poleg tega so avtorji ugotovili, da je ATPγS oslabil delovanje NSP13 preko več različnih kinetičnih procesov. Vendar je bil prevladujoči mehanizem odvisen od uporabe podporne sile. Čeprav ATPγS ni uspešen kandidat za zdravilo za NSP13, je pokazal moč SPRNT pri preučevanju mehanizmov inhibicije helikaze. Ugotovljene so bile tri metode inhibicije NSP13:

i) zmanjšanje njegove procesnosti,

ii) preprečevanje spajanja njegovih domen 1A in 2A po vezavi nukleotidov in

iii) Upočasnitev hidrolize ATPγS v primerjavi z ATP.

Sklepi

Na splošno je študija izpostavila SPRNT kot dragoceno in močno orodje za raziskovanje vloge NSP13 znotraj replikacijskega in transkripcijskega kompleksa (RTC) SARS-CoV-2. Metoda SPRNT je pokazala tudi vrhunsko sposobnost olajšanja študija kinetike translokacije NSP13 ali katere koli helikaze, tudi če ni dupleksa. Poleg tega bi lahko poskusi SPRNT olajšali preučevanje NSP13 na nativnih sekvencah SARS-CoV-2, da bi osvetlili specifične elemente zaporedja visoko strukturiranega genoma SARS-CoV-2 in njihovo vlogo pri regulaciji NSP13.

*Pomembna OPOMBA:bioRxiv objavlja predhodna znanstvena poročila, ki niso strokovno pregledana in se zato ne bi smela šteti za dokončna, namenjena usmerjanju klinične prakse/vedenja v zvezi z zdravjem ali jih obravnavati kot uveljavljene informacije.

Referenca:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Sinduja K. Marx, Keith J. Mickolajczyk, Jonathan M. Craig, Christopher A. Thomas, Akira M. Pfeffer, Sarah J. Abell, Jessica D. Carrasco, Michaela C. Franzi, Jesse R. Huang, Hwanhee C. Kim, Henry D. Brinkerhoff, Tarun M. Kapoor, Jens H. Gundlach, Andrew H. Laszlo. (2022). Hemmung der SARS-CoV-2-Helikase mit Einzelnukleotidauflösung. bioRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.10.07.511351 https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.10.07.511351v1