Ny metod använder nanopore pincett för att underlätta hämning av SARS-CoV-2-helikas vid en nukleotidupplösning

Ny metod använder nanopore pincett för att underlätta hämning av SARS-CoV-2-helikas vid en nukleotidupplösning

I en nyligen publicerad studie publicerad i bioRxiv * Preprint-server: Forskare visualiserade verkningsmekanismen och hämningen av icke-strukturellt protein 13 (NSP13) av allvarligt akut respiratoriskt syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) med hög spatiotemporal upplösning.

Studie: Hemmung der SARS-CoV-2-Helikase mit Einzelnukleotidauflösung. Bildnachweis: atdigit/Shutterstock

*Viktig OBS:bioRxiv publicerar preliminära vetenskapliga rapporter som inte är peer-reviewed och därför inte ska anses vara avgörande, avsedda att vägleda klinisk praxis/hälsorelaterat beteende eller behandlas som etablerad information.

bakgrund

Av alla 15 SARS-COV-2 NSP:er är NSP13, ett ribonukleinsyra (RNA) helikas, avgörande för dess replikation. Det finns dock för närvarande inga godkända antivirala läkemedel som riktar sig mot NSP13. Till skillnad från strukturella SARS-CoV-2-proteiner är aminosyrasekvensen för nsp13 en av de mest bevarade bland många typer av coronavirus (CoV) (t.ex. Mellanöstern Respiratory Syndrome CoV) och SARS-CoV-2-varianter av oro (VOC). inklusive Omicron. Sammantaget gör detta nsp13 till ett attraktivt bredspektrum antiviralt mål med potential att bekämpa framtida CoV-utbrott.

Strukturella och biokemiska studier har visat att nsp13 är en superfamilj 1B (SF1B) RNA-helikas. Den använder en tummaskmekanism för translokation längs enkelsträngade (ss) nukleinsyrasubstrat (NA), genom vilka nsp13 sannolikt lindar upp NA-duplex. På grund av sin lilla stegstorlek kunde enkelmolekyltekniker inte dechiffrera hastigheten med vilken nsp13 rör sig längs sitt NA-substrat. Sådan upplösning skulle kunna ge insikt i hur hämmande molekyler påverkar deras verkningssätt.

Om studien

I den aktuella studien utvecklade forskare en molekyl picometer resolution nanopore pincett (SPRNT) för att mäta stegen för SARS-CoV-2 nsp13 rörelse på DNA-strängar. Dessutom visade de hur SPRNT kan användas för att bestämma verkningsmekanismen för en helikashämmare. Teamet designade en enda nanopor av Mycobacterium smegmatis porin A (MspA) i ett fosfolipiddubbelskikt. En spänning applicerad på detta membran fick en ström av joner att flöda genom nanoporen, vilket drog negativt laddat NA genom poren.

Olika NA-baser inom nanoporen orsakade unika jonströmsblock som kunde avkodas till NA-sekvensen. En helikas bunden till den fångade NA-strängen kommer att vila vid porkanten och drar NA, vilket leder till successiva jonströmssteg. Teamet löste dessa i singelnukleotidsteg på submillisekunders tidsskalor för att observera helikasens rörelse längs NA. Samtidigt bestämde de NA-sekvensen för substratet i helikasen.

Det är också anmärkningsvärt att SPRNT utövade en kraft som var proportionell mot den applicerade spänningen på enzym/NA-komplexet, vilket stödde eller motstod rörelsen av nsp13, beroende på vilken ände av nanopore NA var bunden till. Dessutom observerade teamet rörelsen av NSP13 längs NAs i närvaro av adenosintrifosfatas (ATPas)-hämmaren ATPγS.

Studieresultat

Forskarna registrerade 2 413 individuella NSP13-translokations- och avvecklingshändelser och 27 641 helikassteg. Studieresultaten bekräftade att NSP13 translokerades längs ssDNA och avlindade DNA-duplexer med en hastighet av cirka 100 baspar per sekund. NSP13-translokationshastigheten var ATP-beroende, med den maximala reaktionshastigheten (Vmax) mellan 600 och 3000 s−1 och Michaelis-konstanten (Km) mellan 100 och 700 µM för ATP, beroende på den underliggande sekvenskontexten inom NSP13. Så stora skillnader i translokationshastigheter vid olika DNA-positioner antydde att NA-basidentitet påverkade NSP13-translokationskinetiken.

Studieresultaten visade också att NSP13-DNA-komplexet var mindre stabilt och var lättare att bryta isär med kraft. Att variera stödkraften från ~24 PicoNewtons (pN) till ~44 pN vid mättad ATP orsakade inte en signifikant förändring i den genomsnittliga translokationshastigheten för NSP13. Dessutom antydde detta att NSP13-translokation övervägande var en ATP-hydrolysdriven rörelse.

Författarna fann också att stegen för att avveckla dsDNA-duplexet var (i genomsnitt) nästan åtta gånger längre än de för ssDNA-translokation. Dessutom var avveckling av dsDNA långsammare än translokation av ssDNA, även om deras uppehållstider var korrelerade. En liknande effekt observerades i en annan studie som undersökte SF1A-helikas PcrA med användning av SPRNT. Intressant nog bildar det RNA-beroende RNA-polymeraset (RdRp) av SARS-CoV-2 och NSP13 ett komplex vid ungefär 170 nt/s vid 37°C, liknande vad som observerades som NSP13-avlindningshastighet med SPRNT.

Dessutom fann författarna att ATPγS försämrade verkan av NSP13 via flera olika kinetiska processer. Den dominerande mekanismen var dock beroende av appliceringen av stödkraft. Även om ATPγS inte är en livskraftig läkemedelskandidat för NSP13, visade det kraften hos SPRNT för att studera mekanismerna för helikashämning. Tre metoder för NSP13-hämning har identifierats:

i) minska dess processivitet,

ii) förhindrar sammanfogningen av dess domäner 1A och 2A efter nukleotidbindning och

iii) Bromsning av ATPγS-hydrolys jämfört med ATP.

Slutsatser

Sammantaget lyfte studien fram SPRNT som ett värdefullt och kraftfullt verktyg för att undersöka rollen för NSP13 inom replikations- och transkriptionskomplexet (RTC) av SARS-CoV-2. SPRNT-metoden visade också en överlägsen förmåga att underlätta studiet av kinetiken för NSP13-translokation eller någon helikas, även i frånvaro av en duplex. Vidare kan SPRNT-experiment underlätta studiet av NSP13 på infödda SARS-CoV-2-sekvenser för att belysa specifika sekvenselement i det högstrukturerade SARS-CoV-2-genomet och deras roll i NSP13-reglering.

*Viktig OBS:bioRxiv publicerar preliminära vetenskapliga rapporter som inte är peer-reviewed och därför inte ska anses vara avgörande, avsedda att vägleda klinisk praxis/hälsorelaterat beteende eller behandlas som etablerad information.

Hänvisning:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Sinduja K. Marx, Keith J. Mickolajczyk, Jonathan M. Craig, Christopher A. Thomas, Akira M. Pfeffer, Sarah J. Abell, Jessica D. Carrasco, Michaela C. Franzi, Jesse R. Huang, Hwanhee C. Kim, Henry D. Brinkerhoff, Tarun M. Kapoor, Jens H. Gundlach, Andrew H. Laszlo. (2022). Hemmung der SARS-CoV-2-Helikase mit Einzelnukleotidauflösung. bioRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.10.07.511351 https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.10.07.511351v1