Проучването заключава, че вирусът на маймунската шарка може лесно да бъде открит чрез qPCR с помощта на три клинично валидирани анализа

Проучването заключава, че вирусът на маймунската шарка може лесно да бъде открит чрез qPCR с помощта на три клинично валидирани анализа

В наскоро публикувано проучване medRxiv *, Изследователите са валидирали количествени тестове за полимеразна верижна реакция (qPCR) на вируса на маймунската шарка (MPXV).

Lernen: Bewertung und klinische Validierung von Affenpockenvirus-Echtzeit-PCR-Assays. Bildnachweis: Oscar Martinez Troncoso/Shutterstock

фон

Случаите на човешката маймунска шарка (MPX) рядко са били откривани извън ендемичните за MPXV страни от откриването й през 70-те години. Тази зоонозна болест беше пренебрегвана до продължаващото огнище, въпреки предупрежденията за глобално разпространение и доказателствата за нарастващо предаване от човек на човек. Като част от продължаващото огнище на MPX са докладвани повече от 77 000 случая на MPX от над 100 държави.

Случаите на MPX могат да се проявят с треска, лимфаденопатия и папиларен обрив. Имунокомпрометираните индивиди са изложени на риск от тежки MPX прояви и дори смърт. Антивирусното лекарство Tecovirimat (Tpoxx) и ваксината JYNNEOS, първоначално разработени за едра шарка, са единствените контрамерки срещу MPX. Тъй като е необходимо ранно и бързо откриване на вируси за профилактика и лечение на MPX, разработването на qPCR анализи е от решаващо значение за прекъсване на предавателните мрежи.

Проучването и резултатите

В настоящото проучване изследователите оцениха два MPXV-специфични qPCR анализа, насочени към G2R и F3L локусите и сравниха тяхната чувствителност, специфичност и точност с теста за пан-ортопоксвирус (OPXV-E9L) на Центъра за контрол и превенция на заболяванията (CDC). Авторите закупиха с търговска цел синтетична MPXV ДНК (VR-3270SD) поради ограниченото предлагане на клинични MPXV проби и геномна ДНК през пролетта на 2022 г.

Закупеният шаблон (VR-3270SD) имаше места за свързване за праймери и сонди за множество предварително разработени анализи. Изследователите оценяват точния брой копия на този стандарт чрез дигитален PCR с капчици (ddPCR) на 1,29 x 108 копия/ml за локусите MPXV-F3L и OPXV-E9L и 1,3 x 108 копия/ml за локуса MPXV-G2R.

Авторите са тествали 15 положителни за вируса на херпес симплекс (HSV), 17 положителни за вируса на варицела-зостер (VZV) и 52 HSV/VZV-отрицателни проби от кожен тампон, използвайки теста OPXV-E9L и са потвърдили, че са отрицателни за MPXV. Анализът F3L не открива ДНК на MPXV в тези проби, докато при анализа на G2R, VZV-позитивна проба е намерена положителна за G2R, но тестът G2R е отрицателен при повторение.

Анализите G2R и F3L показаха отрицателно процентно съгласие съответно от 98,8% и 100% в 84 проби. След това екипът тества кръстосаната реактивност на анализите на MPXV с вируси на камилска шарка (CMLV), кравешка шарка (CPXV) и ваксиния (VACV), които са близки филогенетични роднини на MPXV. Анализите MPXV-F3L и G2R не откриха ДНК на CMLV, CPXV и VACV, докато анализът OPXV-E9L показа средни прагове на цикъла (Ct) съответно от 19,8, 25,8 и 23,8.

Електронна книга по генетика и геномика

Компилация от най-добрите интервюта, статии и новини от последната година. Изтеглете безплатно копие

Способността за откриване на MPXV ДНК беше оценена с помощта на изкуствени положителни резултати. Положителният процент на съгласие беше 100% за анализа OPXV E9L и 99,1% за анализите MPXV G2R и F3L. Освен това те тестваха дали G2R и F3L анализите ще открият точно MPXV в (клинични) проби и осигуриха седем MPXV-положителни проби от кожен тампон от лаборатория за обществено здраве (PHL).

PHL пробите бяха разредени 1:40 преди екстракция поради ограничения на обема. Двадесет клинични MPXV проби, които са дали положителен резултат при F3L теста, са тествани едновременно с OPXV-E9L и MPXV-G2R анализи. MPXV-специфичните анализи имат средно по-ниски стойности на Ct от анализа OPXV-E9L за всяка проба. Освен това, G2R анализът има по-ниска стойност на Ct от F3L теста във всяка проба, в съответствие с две G2R копия в MPXV генома.

Изследователите оценяват границата на откриване (LoD) на 330 копия/mL, което съответства на 3,3 копия на (PCR) реакция, използвайки стандартни методи за екстракция за MPXV F3L и G2R анализи. Те също така валидираха анализа MPXV-F3L, използвайки различни типове проби като: B. CSF, урина, серум, плазма, цяла кръв и орални/ректални/назофарингеални/вагинални тампони.

Отрицателното процентно съгласие беше 100% за всички типове проби. Положителният процент на съгласие е 100% за назофарингеални/ректални/вагинални тампони, плазма, CSF, цяла кръв и кърма, 95,7% за проби от урина и 95,5% за серумни проби. LoD за тези проби се оценява на 1000 копия/mL (10 копия/mL на реакция).

Използвайки клинични MPXV проби, отрицателното процентно съгласие е 100% за слюнка, сперма и ректални/орални/сухи тампони. Положителният процент на съгласие е 100% за слюнка, ректални тампони и сперма и 95% за перорални/сухи тампони. LoD за анализа F3L беше 260 копия/mL за сперма, 780 копия/mL за слюнка, ректални и орални тампони и 810 копия/намазка за сухи тампони.

Изводи

В обобщение, настоящото проучване оценява чувствителността и специфичността на MPXV-специфични набори от праймери и сонди заедно с пан-ортопоксвирусен анализ. LoD за тези анализи беше само 3,3 копия на (PCR) реакция чрез екстракция от до 250 μL проба. Нито един от анализите не показва кръстосана реактивност с VZV или HSV, което показва висока специфичност.

Като цяло ефективността на трите анализа за откриване на MPXV е сравнима, като всеки е силно чувствителен към MPXV ДНК. Тестът MPXV-F3L има висока специфичност за MPXV и не показва кръстосана реактивност с HSV или други ортопоксвируси и ще бъде критичен инструмент за намаляване на предаването на MPXV в продължаващото огнище.

*Важна ЗАБЕЛЕЖКА

medRxiv публикува предварителни научни доклади, които не са били рецензирани от партньори и следователно не трябва да се считат за убедителни, да ръководят клиничната практика/поведение, свързано със здравето, или да се третират като установена информация.

Справка:

• Mills, M. et al. (2022) „Bewertung und klinische Validierung von Affenpockenvirus-Echtzeit-PCR-Assays“. medRxiv. doi: 10.1101/2022.11.12.22282254. https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.11.12.22282254v1

.