Studie dochází k závěru, že virus opičích neštovic lze snadno detekovat pomocí qPCR pomocí tří klinicky ověřených testů

Studie dochází k závěru, že virus opičích neštovic lze snadno detekovat pomocí qPCR pomocí tří klinicky ověřených testů

V nedávno zveřejněné studii medRxiv *, Výzkumníci potvrdili kvantitativní polymerázovou řetězovou reakci (qPCR) s virem opičích neštovic (MPXV).

Lernen: Bewertung und klinische Validierung von Affenpockenvirus-Echtzeit-PCR-Assays. Bildnachweis: Oscar Martinez Troncoso/Shutterstock

pozadí

Případy lidských opičích neštovic (MPX) byly zřídka zjištěny mimo země s endemickým výskytem MPXV od jeho objevení v 70. letech 20. století. Tato zoonotická choroba byla až do pokračující epidemie zanedbávána, a to navzdory varováním o globálním šíření a důkazům o zvyšujícím se přenosu z člověka na člověka. V rámci probíhající epidemie MPX bylo hlášeno více než 77 000 případů MPX z více než 100 zemí.

Případy MPX se mohou projevit horečkou, lymfadenopatií a papilární vyrážkou. Imunokompromitovaní jedinci jsou ohroženi závažnými projevy MPX a dokonce smrtí. Antivirotikum Tecovirimat (Tpoxx) a vakcína JYNNEOS, původně vyvinutá proti pravým neštovicím, jsou jedinými protiopatřeními proti MPX. Vzhledem k tomu, že pro prevenci a léčbu MPX je nutná včasná a rychlá detekce viru, je vývoj testů qPCR zásadní pro narušení přenosových sítí.

Studie a výsledky

V této studii vědci vyhodnotili dva testy qPCR specifické pro MPXV zaměřené na lokusy G2R a F3L a porovnali jejich citlivost, specificitu a přesnost s panortopoxvirovým testem Centers for Disease Control and Prevention (CDC) (OPXV-E9L). Autoři komerčně zakoupili syntetickou DNA MPXV (VR-3270SD) kvůli omezené nabídce klinických vzorků MPXV a genomové DNA na jaře 2022.

Zakoupený templát (VR-3270SD) měl vazebná místa pro primery a sondy pro četné dříve vyvinuté testy. Výzkumníci odhadli přesný počet kopií tohoto standardu pomocí kapkové digitální PCR (ddPCR) na 1,29 x 108 kopií/ml pro lokusy MPXV-F3L a OPXV-E9L a 1,3 x 108 kopií/ml pro lokus MPXV-G2R.

Autoři testovali 15 vzorků kožních výtěrů pozitivních na virus herpes simplex (HSV), 17 pozitivních na virus varicella-zoster (VZV) a 52 negativních na HSV/VZV pomocí testu OPXV-E9L a ověřili, že jsou negativní na MPXV. Test F3L v těchto vzorcích nedetekoval DNA MPXV, zatímco v testu G2R byl vzorek pozitivní na VZV shledán pozitivní na G2R, ale při opakování byl testován na G2R negativní.

Testy G2R a F3L ukázaly negativní procentuální shodu 98,8 % a 100 % v 84 vzorcích. Dále tým testoval zkříženou reaktivitu testů MPXV s viry velbloudích neštovic (CMLV), kravských neštovic (CPXV) a vakcínie (VACV), které jsou blízkými fylogenetickými příbuznými MPXV. Testy MPXV-F3L a G2R nedetekovaly DNA CMLV, CPXV a VACV, zatímco test OPXV-E9L ukázal průměrné prahové hodnoty cyklu (Ct) 19,8, 25,8 a 23,8, v daném pořadí.

Elektronická kniha Genetika a genomika

Kompilace top rozhovorů, článků a novinek za poslední rok. Stáhněte si bezplatnou kopii

Schopnost detekovat MPXV DNA byla hodnocena pomocí umělých pozitivních výsledků. Pozitivní procentuální shoda byla 100 % pro test OPXV E9L a 99,1 % pro testy MPXV G2R a F3L. Kromě toho testovali, zda by testy G2R a F3L přesně detekovaly MPXV v (klinických) vzorcích, a zajistili sedm vzorků kožních výtěrů pozitivních na MPXV z laboratoře veřejného zdraví (PHL).

Vzorky PHL byly před extrakcí zředěny v poměru 1:40 z důvodu omezení objemu. Dvacet klinických vzorků MPXV, které byly pozitivní v testu F3L, bylo testováno současně s testy OPXV-E9L a MPXV-G2R. Testy specifické pro MPXV měly v průměru nižší hodnoty Ct než test OPXV-E9L pro každý vzorek. Kromě toho měl test G2R v každém vzorku nižší hodnotu Ct než test F3L, což je v souladu se dvěma kopiemi G2R v genomu MPXV.

Vědci odhadli limit detekce (LoD) na 330 kopií/ml, což odpovídá 3,3 kopiím na (PCR) reakci za použití standardních extrakčních metod pro testy MPXV F3L a G2R. Také validovali test MPXV-F3L pomocí různých typů vzorků, jako jsou: B. CSF, moč, sérum, plazma, plná krev a orální/rektální/nazofaryngeální/vaginální výtěry.

Negativní procentuální shoda byla 100 % pro všechny typy vzorků. Pozitivní procentuální shoda byla 100 % pro výtěry z nosohltanu/rekta/vaginy, plazmu, CSF, plnou krev a mateřské mléko, 95,7 % pro vzorky moči a 95,5 % pro vzorky séra. LoD pro tyto vzorky byla odhadnuta na 1000 kopií/ml (10 kopií/ml na reakci).

Při použití klinických vzorků MPXV byla negativní procentuální shoda 100% pro sliny, sperma a rektální/orální/suché výtěry. Pozitivní procentuální shoda byla 100 % pro sliny, rektální výtěry a sperma a 95 % pro ústní/suché výtěry. LoD pro test F3L byla 260 kopií/ml pro sperma, 780 kopií/ml pro sliny, rektální a orální výtěry a 810 kopií/nátěr pro suché výtěry.

Závěry

Souhrnně, tato studie hodnotila citlivost a specificitu MPXV-specifických sad primerů a sond spolu s pan-orthopoxvirovým testem. LoD pro tyto testy byla pouze 3,3 kopií na reakci (PCR) extrakcí až z 250 μl vzorku. Žádný z testů nevykázal zkříženou reaktivitu s VZV nebo HSV, což ukazuje na vysokou specificitu.

Celkově byla účinnost tří testů pro detekci MPXV srovnatelná, přičemž každý z nich byl vysoce citlivý na DNA MPXV. Test MPXV-F3L měl vysokou specifitu pro MPXV a nevykazoval žádnou zkříženou reaktivitu s HSV nebo jinými orthopoxviry a bude kritickým nástrojem při snižování přenosu MPXV v probíhající epidemii.

*Důležitá POZNÁMKA

medRxiv publikuje předběžné vědecké zprávy, které nebyly recenzovány, a proto by neměly být považovány za průkazné, řídit klinickou praxi/chování související se zdravím, ani by se s nimi nemělo zacházet jako s ověřenými informacemi.

Odkaz:

• Mills, M. et al. (2022) „Bewertung und klinische Validierung von Affenpockenvirus-Echtzeit-PCR-Assays“. medRxiv. doi: 10.1101/2022.11.12.22282254. https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.11.12.22282254v1

.