Undersøgelsen konkluderer, at monkeypox virus let kan påvises ved qPCR ved hjælp af tre klinisk validerede assays

Undersøgelsen konkluderer, at monkeypox virus let kan påvises ved qPCR ved hjælp af tre klinisk validerede assays

I en nyligt offentliggjort undersøgelse medRxiv *, Forskere validerede monkeypox virus (MPXV) kvantitative polymerase chain reaction (qPCR) assays.

Lernen: Bewertung und klinische Validierung von Affenpockenvirus-Echtzeit-PCR-Assays. Bildnachweis: Oscar Martinez Troncoso/Shutterstock

baggrund

Humane abekopper (MPX) tilfælde er sjældent blevet opdaget uden for MPXV-endemiske lande siden dets opdagelse i 1970'erne. Denne zoonotiske sygdom blev forsømt indtil det igangværende udbrud, på trods af advarsler om global spredning og tegn på stigende menneske-til-menneske-overførsel. Som en del af det igangværende MPX-udbrud er der rapporteret mere end 77.000 MPX-tilfælde fra over 100 lande.

MPX-tilfælde kan vise sig med feber, lymfadenopati og papillært udslæt. Immunkompromitterede individer er i risiko for alvorlige MPX-manifestationer og endda død. Det antivirale lægemiddel Tecovirimat (Tpoxx) og vaccinen JYNNEOS, der oprindeligt er udviklet til kopper, er de eneste modforanstaltninger mod MPX. Fordi tidlig og hurtig virusdetektion er påkrævet til MPX-forebyggelse og behandling, er udviklingen af ​​qPCR-assays afgørende for at forstyrre transmissionsnetværk.

Undersøgelsen og resultaterne

I denne undersøgelse evaluerede forskere to MPXV-specifikke qPCR-assays rettet mod G2R- og F3L-loci og sammenlignede deres sensitivitet, specificitet og nøjagtighed med Centers for Disease Control and Prevention (CDC) pan-orthopoxvirus-assay (OPXV-E9L). Forfatterne købte kommercielt syntetisk MPXV DNA (VR-3270SD) på grund af det begrænsede udbud af kliniske MPXV-prøver og genomisk DNA i foråret 2022.

Den købte skabelon (VR-3270SD) havde bindingssteder for primere og prober til adskillige tidligere udviklede assays. Forskerne estimerede det nøjagtige kopiantal af denne standard ved dråbe digital PCR (ddPCR) til at være 1,29 x 108 kopier/ml for MPXV-F3L og OPXV-E9L loci og 1,3 x 108 kopier/ml for MPXV-G2R locus.

Forfatterne testede 15 herpes simplex-virus (HSV)-positive, 17 varicella-zoster-virus (VZV)-positive og 52 HSV/VZV-negative hudpodningsprøver ved hjælp af OPXV-E9L-analysen og verificerede, at de var negative for MPXV. F3L-analysen påviste ikke MPXV-DNA i disse prøver, mens en VZV-positiv prøve i G2R-analysen blev fundet positiv for G2R, men testede G2R-negativ, når den blev gentaget.

G2R- og F3L-assayene viste en negativ procentvis overensstemmelse på henholdsvis 98,8 % og 100 % i 84 prøver. Derefter testede holdet krydsreaktiviteten af ​​MPXV-assays med kamkopper (CMLV), kokopper (CPXV) og vaccinia (VACV) vira, som er nære fylogenetiske slægtninge til MPXV. MPXV-F3L- og G2R-assays detekterede ikke DNA'erne fra CMLV, CPXV og VACV, mens OPXV-E9L-assayet viste gennemsnitlige cyklustærskler (Ct) på henholdsvis 19,8, 25,8 og 23,8.

Genetik og genomik e-bog

Samling af de bedste interviews, artikler og nyheder fra det sidste år. Download en gratis kopi

Evnen til at påvise MPXV DNA blev vurderet ved hjælp af kunstige positive resultater. Den positive procentvise overensstemmelse var 100 % for OPXV E9L-analysen og 99,1 % for MPXV G2R- og F3L-analysen. Derudover testede de, om G2R- og F3L-assays nøjagtigt ville detektere MPXV i (kliniske) prøver og sikrede syv MPXV-positive hudpodningsprøver fra et offentligt sundhedslaboratorium (PHL).

PHL-prøverne blev fortyndet 1:40 før ekstraktion på grund af volumenbegrænsninger. Tyve kliniske MPXV-prøver, der testede positive i F3L-assayet, blev testet samtidigt med OPXV-E9L- og MPXV-G2R-assays. De MPXV-specifikke assays havde i gennemsnit lavere Ct-værdier end OPXV-E9L assayet for hver prøve. Ydermere havde G2R-assayet en lavere Ct-værdi end F3L-assayet i hver prøve, i overensstemmelse med to G2R-kopier i MPXV-genomet.

Forskerne estimerede grænsen for detektion (LoD) til at være 330 kopier/ml, hvilket svarer til 3,3 kopier pr. (PCR) reaktion ved brug af standardekstraktionsmetoder til MPXV F3L og G2R assays. De validerede også MPXV-F3L assayet ved hjælp af forskellige prøvetyper såsom: B. CSF, urin, serum, plasma, fuldblod og orale/rektale/nasopharyngeale/vaginale podninger.

Den negative procentvise overensstemmelse var 100 % for alle prøvetyper. Den positive procentvise overensstemmelse var 100 % for nasopharyngeale/rektale/vaginale podninger, plasma, CSF, fuldblod og modermælk, 95,7 % for urinprøver og 95,5 % for serumprøver. LoD for disse prøver blev estimeret til at være 1000 kopier/ml (10 kopier/ml pr. reaktion).

Ved brug af kliniske MPXV-prøver var den negative procentvise overensstemmelse 100 % for spyt, sæd og rektale/orale/tørre podninger. Den positive procentvise overensstemmelse var 100 % for spyt, rektale podninger og sæd og 95 % for orale/tørre podninger. LoD for F3L-analysen var 260 kopier/ml for sæd, 780 kopier/ml for spyt, rektale og orale podninger og 810 kopier/udstrygning for tørre podninger.

Konklusioner

Sammenfattende evaluerede den foreliggende undersøgelse sensitiviteten og specificiteten af ​​MPXV-specifikke primer- og probesæt sammen med et pan-orthopoxvirus-assay. LoD for disse assays var så lavt som 3,3 kopier pr. (PCR) reaktion ved ekstraktion fra op til 250 μL prøve. Ingen af ​​assayene viste krydsreaktivitet med VZV eller HSV, hvilket indikerer høj specificitet.

Samlet set var ydeevnen af ​​de tre assays til MPXV-detektion sammenlignelig, idet hver af dem var meget følsomme for MPXV-DNA. MPXV-F3L-analysen havde høj specificitet for MPXV og viste ingen krydsreaktivitet med HSV eller andre orthopoxvirus og vil være et kritisk værktøj til at reducere MPXV-transmission i det igangværende udbrud.

*Vigtig BEMÆRK

medRxiv udgiver foreløbige videnskabelige rapporter, der ikke er blevet peer-reviewet og derfor ikke bør betragtes som afgørende, vejlede klinisk praksis/sundhedsrelateret adfærd eller behandles som etableret information.

Reference:

• Mills, M. et al. (2022) „Bewertung und klinische Validierung von Affenpockenvirus-Echtzeit-PCR-Assays“. medRxiv. doi: 10.1101/2022.11.12.22282254. https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.11.12.22282254v1

.