Η μελέτη καταλήγει στο συμπέρασμα ότι ο ιός της ευλογιάς των πιθήκων μπορεί εύκολα να ανιχνευθεί με qPCR χρησιμοποιώντας τρεις κλινικά επικυρωμένες αναλύσεις

Η μελέτη καταλήγει στο συμπέρασμα ότι ο ιός της ευλογιάς των πιθήκων μπορεί εύκολα να ανιχνευθεί με qPCR χρησιμοποιώντας τρεις κλινικά επικυρωμένες αναλύσεις

Σε μελέτη που δημοσιεύτηκε πρόσφατα medRxiv *, Οι ερευνητές επικύρωσαν δοκιμές ποσοτικής αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (qPCR) του ιού της ευλογιάς των πιθήκων (MPXV).

Lernen: Bewertung und klinische Validierung von Affenpockenvirus-Echtzeit-PCR-Assays. Bildnachweis: Oscar Martinez Troncoso/Shutterstock

φόντο

Οι περιπτώσεις ανθρώπινης ευλογιάς των πιθήκων (MPX) έχουν ανιχνευθεί σπάνια εκτός των ενδημικών χωρών MPXV από την ανακάλυψή της στη δεκαετία του 1970. Αυτή η ζωονοσογόνος νόσος παραμελήθηκε μέχρι το συνεχιζόμενο ξέσπασμα, παρά τις προειδοποιήσεις για παγκόσμια εξάπλωση και τα στοιχεία για αυξανόμενη μετάδοση από άνθρωπο σε άνθρωπο. Ως μέρος της συνεχιζόμενης επιδημίας MPX, έχουν αναφερθεί περισσότερα από 77.000 κρούσματα MPX από περισσότερες από 100 χώρες.

Οι περιπτώσεις MPX μπορεί να εμφανιστούν με πυρετό, λεμφαδενοπάθεια και θηλώδες εξάνθημα. Τα ανοσοκατεσταλμένα άτομα διατρέχουν κίνδυνο σοβαρών εκδηλώσεων MPX και ακόμη και θανάτου. Το αντιικό φάρμακο Tecovirimat (Tpoxx) και το εμβόλιο JYNNEOS, που αναπτύχθηκε αρχικά για την ευλογιά, είναι τα μόνα αντίμετρα κατά του MPX. Επειδή απαιτείται έγκαιρη και ταχεία ανίχνευση του ιού για την πρόληψη και τη θεραπεία MPX, η ανάπτυξη προσδιορισμών qPCR είναι κρίσιμη για τη διακοπή των δικτύων μετάδοσης.

Η μελέτη και τα αποτελέσματα

Στην παρούσα μελέτη, οι ερευνητές αξιολόγησαν δύο ειδικές για MPXV δοκιμές qPCR που στοχεύουν τους τόπους G2R και F3L και συνέκριναν την ευαισθησία, την ειδικότητα και την ακρίβειά τους με τον προσδιορισμό πανορθοποξικού ιού του Κέντρου Ελέγχου και Πρόληψης (CDC) (OPXV-E9L). Οι συγγραφείς αγόρασαν εμπορικά συνθετικό MPXV DNA (VR-3270SD) λόγω της περιορισμένης προσφοράς κλινικών δειγμάτων MPXV και γονιδιωματικού DNA την άνοιξη του 2022.

Το αγορασμένο πρότυπο (VR-3270SD) είχε θέσεις δέσμευσης για εκκινητές και ανιχνευτές για πολυάριθμες δοκιμασίες που είχαν αναπτυχθεί προηγουμένως. Οι ερευνητές υπολόγισαν τον ακριβή αριθμό αντιγράφων αυτού του προτύπου με σταγονοειδή ψηφιακή PCR (ddPCR) σε 1,29 x 108 αντίγραφα/ml για τους τόπους MPXV-F3L και OPXV-E9L και 1,3 x 108 αντίγραφα/ml για τον τόπο MPXV-G2R.

Οι συγγραφείς εξέτασαν 15 θετικά για τον ιό του απλού έρπητα (HSV), 17 θετικά για τον ιό της ανεμευλογιάς-ζωστήρα (VZV) και 52 δείγματα δερματικών επιχρισμάτων αρνητικών HSV/VZV χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία OPXV-E9L και επαλήθευσαν ότι ήταν αρνητικά για MPXV. Ο προσδιορισμός F3L δεν ανίχνευσε MPXV DNA σε αυτά τα δείγματα, ενώ στον προσδιορισμό G2R, ένα θετικό σε VZV δείγμα βρέθηκε θετικό για G2R αλλά εξετάστηκε αρνητικό στο G2R όταν επαναλήφθηκε.

Οι αναλύσεις G2R και F3L έδειξαν αρνητική ποσοστιαία συμφωνία 98,8% και 100%, αντίστοιχα, σε 84 δείγματα. Στη συνέχεια, η ομάδα εξέτασε τη διασταυρούμενη αντιδραστικότητα των αναλύσεων MPXV με ιούς ευλογιάς καμήλας (CMLV), ευλογιάς αγελάδων (CPXV) και δαμαλίτιδας (VACV), οι οποίοι είναι στενοί φυλογενετικοί συγγενείς του MPXV. Οι αναλύσεις MPXV-F3L και G2R δεν ανίχνευσαν τα DNA των CMLV, CPXV και VACV, ενώ η ανάλυση OPXV-E9L έδειξε μέσους ουδούς κύκλου (Ct) 19,8, 25,8 και 23,8, αντίστοιχα.

Ηλεκτρονικό βιβλίο Γενετικής & Γονιδιωματικής

Συγκέντρωση των κορυφαίων συνεντεύξεων, άρθρων και ειδήσεων του περασμένου έτους. Κατεβάστε ένα δωρεάν αντίγραφο

Η ικανότητα ανίχνευσης MPXV DNA αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας τεχνητά θετικά αποτελέσματα. Η θετική ποσοστιαία συμφωνία ήταν 100% για τον προσδιορισμό OPXV E9L και 99,1% για τους προσδιορισμούς MPXV G2R και F3L. Επιπλέον, δοκίμασαν εάν οι αναλύσεις G2R και F3L θα ανίχνευαν με ακρίβεια το MPXV σε (κλινικά) δείγματα και εξασφάλισαν επτά δείγματα επιχρίσματος δέρματος θετικά σε MPXV από εργαστήριο δημόσιας υγείας (PHL).

Τα δείγματα PHL αραιώθηκαν 1:40 πριν από την εκχύλιση λόγω περιορισμών όγκου. Είκοσι κλινικά δείγματα MPXV που βρέθηκαν θετικά στον προσδιορισμό F3L δοκιμάστηκαν ταυτόχρονα με δοκιμές OPXV-E9L και MPXV-G2R. Οι ειδικές για το MPXV δοκιμές είχαν, κατά μέσο όρο, χαμηλότερες τιμές Ct από τη δοκιμασία OPXV-E9L για κάθε δείγμα. Επιπλέον, ο προσδιορισμός G2R είχε χαμηλότερη τιμή Ct από τον προσδιορισμό F3L σε κάθε δείγμα, σύμφωνα με δύο αντίγραφα G2R στο γονιδίωμα MPXV.

Οι ερευνητές υπολόγισαν το όριο ανίχνευσης (LoD) στα 330 αντίγραφα/mL, που αντιστοιχεί σε 3,3 αντίγραφα ανά αντίδραση (PCR) χρησιμοποιώντας τυπικές μεθόδους εκχύλισης για προσδιορισμούς MPXV F3L και G2R. Επικύρωσαν επίσης την ανάλυση MPXV-F3L χρησιμοποιώντας διαφορετικούς τύπους δειγμάτων όπως: Β. ΕΝΥ, ούρα, ορός, πλάσμα, ολικό αίμα και στοματικά/ορθικά/ρινοφάρυγγα/κολπικά επιχρίσματα.

Η αρνητική ποσοστιαία συμφωνία ήταν 100% για όλους τους τύπους δειγμάτων. Η θετική ποσοστιαία συμφωνία ήταν 100% για ρινοφαρυγγικά/ορθικά/κολπικά επιχρίσματα, πλάσμα, ΕΝΥ, πλήρες αίμα και μητρικό γάλα, 95,7% για δείγματα ούρων και 95,5% για δείγματα ορού. Το LoD για αυτά τα δείγματα υπολογίστηκε ότι είναι 1000 αντίγραφα/mL (10 αντίγραφα/mL ανά αντίδραση).

Χρησιμοποιώντας κλινικά δείγματα MPXV, η αρνητική ποσοστιαία συμφωνία ήταν 100% για το σάλιο, το σπέρμα και τα ορθικά/στοματικά/ξηρά επιχρίσματα. Η θετική ποσοστιαία συμφωνία ήταν 100% για το σάλιο, τα επιχρίσματα από το ορθό και το σπέρμα και 95% για τα στοματικά/ξηρά επιχρίσματα. Το LoD για τη δοκιμασία F3L ήταν 260 αντίγραφα/mL για το σπέρμα, 780 αντίγραφα/mL για το σάλιο, τα επιχρίσματα από το ορθό και το στόμα και 810 αντίγραφα/επιχρίσματα για τα στεγνά επιχρίσματα.

συμπεράσματα

Συνοπτικά, η παρούσα μελέτη αξιολόγησε την ευαισθησία και την ειδικότητα των συνόλων εκκινητών και ανιχνευτών ειδικών για MPXV μαζί με μια δοκιμασία πανορθοποξικού ιού. Το LoD για αυτούς τους προσδιορισμούς ήταν τόσο χαμηλό όσο 3,3 αντίγραφα ανά (PCR) αντίδραση με εκχύλιση από έως και 250 μL δείγματος. Καμία από τις δοκιμασίες δεν έδειξε διασταυρούμενη αντιδραστικότητα με VZV ή HSV, υποδεικνύοντας υψηλή ειδικότητα.

Συνολικά, η απόδοση των τριών αναλύσεων για την ανίχνευση MPXV ήταν συγκρίσιμη, με την καθεμία να είναι εξαιρετικά ευαίσθητη για το MPXV DNA. Η ανάλυση MPXV-F3L είχε υψηλή εξειδίκευση για το MPXV και δεν έδειξε διασταυρούμενη αντιδραστικότητα με τον HSV ή άλλους ορθοποξικούς ιούς και θα είναι ένα κρίσιμο εργαλείο για τη μείωση της μετάδοσης MPXV στο συνεχιζόμενο ξέσπασμα.

*Σημαντική ΣΗΜΕΙΩΣΗ

Το medRxiv δημοσιεύει προκαταρκτικές επιστημονικές εκθέσεις που δεν έχουν αξιολογηθεί από ομοτίμους και επομένως δεν πρέπει να θεωρούνται οριστικές, να καθοδηγούν την κλινική πρακτική/σχετική με την υγεία συμπεριφορά ή να αντιμετωπίζονται ως καθιερωμένες πληροφορίες.

Αναφορά:

• Mills, M. et al. (2022) „Bewertung und klinische Validierung von Affenpockenvirus-Echtzeit-PCR-Assays“. medRxiv. doi: 10.1101/2022.11.12.22282254. https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.11.12.22282254v1

.