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El estudio concluye que el virus de la viruela del mono se puede detectar fácilmente mediante qPCR utilizando tres ensayos clínicamente validados
En un estudio publicado recientemente sobre medRxiv*, los investigadores validaron los ensayos de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) del virus de la viruela del simio (MPXV). Aprendizaje: Evaluación y validación clínica de ensayos de PCR en tiempo real del virus de la viruela simica. Crédito de la foto: Oscar Martínez Troncoso/Shutterstock Antecedentes Rara vez se han detectado casos de viruela simica humana (MPX) fuera de los países donde el MPXV es endémico desde su descubrimiento en la década de 1970. Esta enfermedad zoonótica fue desatendida hasta el brote actual, a pesar de las advertencias de propagación global y la evidencia de una creciente transmisión de persona a persona. Como parte del brote actual de MPX, se han notificado más de 77.000 casos de MPX en más de 100 países. Los casos de MPX pueden presentarse con fiebre, linfadenopatía y erupción papilar. En personas inmunocomprometidas existe...
El estudio concluye que el virus de la viruela del mono se puede detectar fácilmente mediante qPCR utilizando tres ensayos clínicamente validados
En un estudio publicado recientemente medRxiv *, Los investigadores validaron ensayos de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) del virus de la viruela del simio (MPXV).
Lernen: Bewertung und klinische Validierung von Affenpockenvirus-Echtzeit-PCR-Assays. Bildnachweis: Oscar Martinez Troncoso/Shutterstock
fondo
Rara vez se han detectado casos de viruela simica humana (MPX) fuera de los países donde el MPXV es endémico desde su descubrimiento en la década de 1970. Esta enfermedad zoonótica fue desatendida hasta el brote actual, a pesar de las advertencias de propagación global y la evidencia de una creciente transmisión de persona a persona. Como parte del brote actual de MPX, se han notificado más de 77.000 casos de MPX en más de 100 países.
Los casos de MPX pueden presentarse con fiebre, linfadenopatía y erupción papilar. Las personas inmunodeprimidas corren el riesgo de sufrir manifestaciones graves de MPX e incluso la muerte. El fármaco antiviral Tecovirimat (Tpoxx) y la vacuna JYNNEOS, desarrollada originalmente para la viruela, son las únicas contramedidas contra el MPX. Debido a que se requiere una detección temprana y rápida del virus para la prevención y el tratamiento de MPX, el desarrollo de ensayos de qPCR es fundamental para interrumpir las redes de transmisión.
El estudio y los resultados.
En el presente estudio, los investigadores evaluaron dos ensayos de qPCR específicos de MPXV dirigidos a los loci G2R y F3L y compararon su sensibilidad, especificidad y precisión con el ensayo de panortopoxvirus (OPXV-E9L) de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC). Los autores compraron comercialmente ADN sintético de MPXV (VR-3270SD) debido al suministro limitado de muestras clínicas de MPXV y ADN genómico en la primavera de 2022.
La plantilla adquirida (VR-3270SD) tenía sitios de unión para cebadores y sondas para numerosos ensayos desarrollados previamente. Los investigadores estimaron que el número de copias exacto de este estándar mediante PCR digital en gotas (ddPCR) era 1,29 x 108 copias/ml para los loci MPXV-F3L y OPXV-E9L y 1,3 x 108 copias/ml para el locus MPXV-G2R.
Los autores analizaron 15 muestras de hisopos de piel positivas para el virus del herpes simple (HSV), 17 positivas para el virus de la varicela-zoster (VZV) y 52 muestras de hisopos de piel negativas para HSV/VZV utilizando el ensayo OPXV-E9L y verificaron que eran negativas para MPXV. El ensayo F3L no detectó ADN de MPXV en estas muestras, mientras que en el ensayo G2R, una muestra positiva para VZV resultó positiva para G2R pero resultó negativa para G2R cuando se repitió.
Los ensayos G2R y F3L mostraron una concordancia porcentual negativa del 98,8 % y 100 %, respectivamente, en 84 muestras. A continuación, el equipo probó la reactividad cruzada de los ensayos de MPXV con los virus de la viruela del camello (CMLV), la viruela vacuna (CPXV) y la vaccinia (VACV), que son parientes filogenéticos cercanos del MPXV. Los ensayos MPXV-F3L y G2R no detectaron los ADN de CMLV, CPXV y VACV, mientras que el ensayo OPXV-E9L mostró umbrales de ciclo promedio (Ct) de 19,8, 25,8 y 23,8, respectivamente.
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La capacidad de detectar ADN de MPXV se evaluó mediante resultados positivos artificiales. El porcentaje de acuerdo positivo fue del 100 % para el ensayo OPXV E9L y del 99,1 % para los ensayos MPXV G2R y F3L. Además, probaron si los ensayos G2R y F3L detectarían con precisión MPXV en muestras (clínicas) y obtuvieron siete muestras de hisopos de piel positivas para MPXV de un laboratorio de salud pública (PHL).
Las muestras de PHL se diluyeron 1:40 antes de la extracción debido a limitaciones de volumen. Veinte muestras clínicas de MPXV que dieron positivo en el ensayo F3L se analizaron simultáneamente con los ensayos OPXV-E9L y MPXV-G2R. Los ensayos específicos de MPXV tuvieron, en promedio, valores de Ct más bajos que el ensayo OPXV-E9L para cada muestra. Además, el ensayo G2R tuvo un valor de Ct más bajo que el ensayo F3L en cada muestra, lo que coincide con dos copias de G2R en el genoma MPXV.
Los investigadores estimaron que el límite de detección (LoD) es de 330 copias/ml, lo que corresponde a 3,3 copias por reacción (PCR) utilizando métodos de extracción estándar para los ensayos MPXV F3L y G2R. También validaron el ensayo MPXV-F3L utilizando diferentes tipos de muestras, como: LCR, orina, suero, plasma, sangre total e hisopos orales/rectales/nasofaríngeos/vaginales.
El porcentaje de acuerdo negativo fue del 100% para todos los tipos de muestra. La concordancia porcentual positiva fue del 100 % para hisopos nasofaríngeos/rectales/vaginales, plasma, LCR, sangre total y leche materna, 95,7 % para muestras de orina y 95,5 % para muestras de suero. Se estimó que el LoD para estas muestras era de 1000 copias/ml (10 copias/ml por reacción).
Utilizando muestras clínicas de MPXV, el porcentaje de concordancia negativa fue del 100% para saliva, semen e hisopos rectales/orales/secos. El porcentaje de acuerdo positivo fue del 100% para saliva, hisopos rectales y semen y del 95% para hisopos orales/secos. El LoD para el ensayo F3L fue de 260 copias/ml para semen, 780 copias/ml para saliva, hisopos rectales y orales, y 810 copias/frotis para hisopos secos.
Conclusiones
En resumen, el presente estudio evaluó la sensibilidad y especificidad de los conjuntos de cebadores y sondas específicos de MPXV junto con un ensayo de pan-ortopoxvirus. El LoD para estos ensayos fue tan bajo como 3,3 copias por reacción (PCR) mediante extracción de hasta 250 μL de muestra. Ninguno de los ensayos mostró reactividad cruzada con VZV o HSV, lo que indica una alta especificidad.
En general, el rendimiento de los tres ensayos para la detección de MPXV fue comparable y cada uno de ellos fue altamente sensible para el ADN de MPXV. El ensayo MPXV-F3L tuvo una alta especificidad para MPXV y no mostró reactividad cruzada con HSV u otros ortopoxvirus y será una herramienta fundamental para reducir la transmisión de MPXV en el brote en curso.
*NOTA IMPORTANTE
medRxiv publica informes científicos preliminares que no han sido revisados por pares y, por lo tanto, no deben considerarse concluyentes, ni guiar la práctica clínica ni el comportamiento relacionado con la salud, ni tratarse como información establecida.
Referencia:
- Mills, M. et al. (2022) „Bewertung und klinische Validierung von Affenpockenvirus-Echtzeit-PCR-Assays“. medRxiv. doi: 10.1101/2022.11.12.22282254. https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.11.12.22282254v1
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