Uuringus jõuti järeldusele, et ahvirõugete viirust saab hõlpsasti tuvastada qPCR abil, kasutades kolme kliiniliselt kinnitatud testi

Uuringus jõuti järeldusele, et ahvirõugete viirust saab hõlpsasti tuvastada qPCR abil, kasutades kolme kliiniliselt kinnitatud testi

Hiljuti avaldatud uuringus medRxiv *, Teadlased kinnitasid ahvirõugete viiruse (MPXV) kvantitatiivse polümeraasi ahelreaktsiooni (qPCR) testid.

Lernen: Bewertung und klinische Validierung von Affenpockenvirus-Echtzeit-PCR-Assays. Bildnachweis: Oscar Martinez Troncoso/Shutterstock

taustal

Inimese ahvirõugete (MPX) juhtumeid on pärast selle avastamist 1970. aastatel väljaspool MPXV endeemilisi riike harva avastatud. Seda zoonootilist haigust jäeti kuni käimasoleva puhanguni tähelepanuta, vaatamata hoiatustele ülemaailmse leviku kohta ja tõenditele leviku suurenemise kohta inimestelt inimesele. Käimasoleva MPX-i puhangu osana on enam kui 100 riigist teatatud enam kui 77 000 MPX juhtumist.

MPX-i juhtudel võivad kaasneda palavik, lümfadenopaatia ja papillaarne lööve. Immuunpuudulikkusega inimestel on raskete MPX-i ilmingute ja isegi surma oht. Viirusevastane ravim Tecovirimat (Tpoxx) ja algselt rõugete vastu välja töötatud vaktsiin JYNNEOS on ainsad vastumeetmed MPX-i vastu. Kuna MPX-i ennetamiseks ja raviks on vaja varajast ja kiiret viiruse tuvastamist, on qPCR-analüüside väljatöötamine ülekandevõrkude katkestamiseks ülioluline.

Uuring ja tulemused

Käesolevas uuringus hindasid teadlased kahte MPXV-spetsiifilist qPCR testi, mis olid suunatud G2R ja F3L lookustele, ning võrdlesid nende tundlikkust, spetsiifilisust ja täpsust haiguste tõrje ja ennetamise keskuste (CDC) pan-ortopoksviiruse testiga (OPXV-E9L). Autorid ostsid kaubanduslikult sünteetilise MPXV DNA (VR-3270SD) kliiniliste MPXV proovide ja genoomse DNA piiratud pakkumise tõttu 2022. aasta kevadel.

Ostetud matriitsil (VR-3270SD) olid paljude varem välja töötatud analüüside jaoks praimerite ja sondide sidumissaidid. Teadlased hindasid selle standardi täpseks koopiaarvuks tilk-digitaalse PCR (ddPCR) abil MPXV-F3L ja OPXV-E9L lookuste puhul 1,29 x 108 koopiat/ml ja MPXV-G2R lookuse puhul 1,3 x 108 koopiat/ml.

Autorid testisid 15 herpes simplex-viiruse (HSV) positiivset, 17 tuulerõugete viiruse (VZV) positiivset ja 52 HSV/VZV-negatiivset nahatampooniproovi, kasutades OPXV-E9L testi ja kontrollisid, et need olid MPXV suhtes negatiivsed. F3L test ei tuvastanud nendes proovides MPXV DNA-d, samas kui G2R testis leiti, et VZV-positiivne proov oli G2R suhtes positiivne, kuid kordusel testiti G2R negatiivset.

G2R ja F3L testid näitasid 84 proovis negatiivset protsendilist kokkulepet vastavalt 98,8% ja 100%. Järgmisena testis töörühm MPXV testide ristreaktiivsust kaambelõugete (CMLV), lehmarõugete (CPXV) ja vaktsiinia (VACV) viirustega, mis on MPXV lähedased fülogeneetilised sugulased. MPXV-F3L ja G2R testid ei tuvastanud CMLV, CPXV ja VACV DNA-sid, samas kui OPXV-E9L test näitas keskmisi tsükliläve (Ct) vastavalt 19,8, 25,8 ja 23,8.

Geneetika ja genoomika e-raamat

Eelmise aasta tippintervjuude, artiklite ja uudiste koostamine. Laadige alla tasuta koopia

MPXV DNA tuvastamise võimet hinnati kunstlike positiivsete tulemuste abil. Positiivne protsentuaalne kokkulepe oli 100% OPXV E9L testi ja 99,1% MPXV G2R ja F3L testi puhul. Lisaks kontrollisid nad, kas G2R- ja F3L-testid tuvastavad MPXV-d täpselt (kliinilistes) proovides, ja tagasid seitse MPXV-positiivset nahatampooniproovi rahvatervise laborist (PHL).

PHL-proove lahjendati mahupiirangute tõttu enne ekstraheerimist suhtega 1:40. 20 kliinilist MPXV proovi, mis osutusid F3L testis positiivseks, testiti samaaegselt OPXV-E9L ja MPXV-G2R testidega. MPXV-spetsiifilistes analüüsides olid iga proovi puhul keskmiselt madalamad Ct väärtused kui OPXV-E9L analüüsil. Lisaks oli G2R testil igas proovis madalam Ct väärtus kui F3L testil, mis on kooskõlas MPXV genoomis kahe G2R koopiaga.

Uurijad hindasid tuvastamispiiriks (LoD) 330 koopiat/ml, mis vastab 3,3 koopiale (PCR) reaktsiooni kohta, kasutades MPXV F3L ja G2R analüüside standardseid ekstraheerimismeetodeid. Samuti valideerisid nad MPXV-F3L testi, kasutades erinevaid proovitüüpe, nagu: B. CSF, uriin, seerum, plasma, täisveri ja suukaudsed/rektaalsed/nasofarüngeaalsed/vaginaalsed tampoonid.

Negatiivne protsentuaalne kokkulepe oli kõigi valimitüüpide puhul 100%. Positiivne protsentuaalne kokkulepe oli 100% nina-neelu/rektaalse/tupe tampooni, plasma, CSF, täisvere ja rinnapiima puhul, 95,7% uriiniproovide ja 95,5% seerumiproovide puhul. Nende proovide LoD oli hinnanguliselt 1000 koopiat/ml (10 koopiat/ml reaktsiooni kohta).

Kasutades kliinilisi MPXV proove, oli sülje, sperma ja rektaalsete/suukaudsete/kuivtampoonide puhul negatiivne protsentuaalne ühtlus 100%. Positiivne protsent oli 100% sülje, rektaalsete tampoonide ja sperma ning 95% suuõõne/kuivtampooni puhul. F3L testi LoD oli 260 koopiat/ml sperma, 780 koopiat/ml sülje, rektaalse ja suu tampooni ja 810 koopiat/äige kuivtampooni puhul.

Järeldused

Kokkuvõttes hinnati käesolevas uuringus MPXV-spetsiifiliste praimerite ja sondikomplektide tundlikkust ja spetsiifilisust koos pan-ortopoksviiruse testiga. Nende testide LoD oli nii madal kui 3,3 koopiat (PCR) reaktsiooni kohta, ekstraheerides kuni 250 μL proovist. Ükski test ei näidanud ristreaktiivsust VZV või HSV-ga, mis viitab kõrgele spetsiifilisusele.

Üldiselt oli kolme MPXV tuvastamise testi jõudlus võrreldav, kusjuures igaüks neist oli MPXV DNA suhtes väga tundlik. MPXV-F3L testil oli MPXV suhtes kõrge spetsiifilisus ja see ei näidanud ristreaktiivsust HSV või teiste ortopoksviirustega ning on kriitilise tähtsusega vahend MPXV leviku vähendamisel käimasoleva haiguspuhangu ajal.

*Oluline MÄRKUS

medRxiv avaldab esialgseid teaduslikke aruandeid, mida ei ole eelretsenseeritud ja mida seetõttu ei tohiks pidada lõplikuks, kliinilise praktika/tervisega seotud käitumise juhisteks ega väljakujunenud teabeks käsitlemiseks.

Viide:

• Mills, M. et al. (2022) „Bewertung und klinische Validierung von Affenpockenvirus-Echtzeit-PCR-Assays“. medRxiv. doi: 10.1101/2022.11.12.22282254. https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.11.12.22282254v1

.