Tutkimuksessa todetaan, että apinapox-virus voidaan helposti havaita qPCR:llä käyttämällä kolmea kliinisesti validoitua määritystä

Tutkimuksessa todetaan, että apinapox-virus voidaan helposti havaita qPCR:llä käyttämällä kolmea kliinisesti validoitua määritystä

Äskettäin julkaistussa tutkimuksessa medRxiv *, Tutkijat validoivat apinapoxviruksen (MPXV) kvantitatiiviset polymeraasiketjureaktio (qPCR) -määritykset.

Lernen: Bewertung und klinische Validierung von Affenpockenvirus-Echtzeit-PCR-Assays. Bildnachweis: Oscar Martinez Troncoso/Shutterstock

tausta

Ihmisen apinapox (MPX) -tapauksia on harvoin havaittu MPXV-endeemisten maiden ulkopuolella sen jälkeen, kun se löydettiin 1970-luvulla. Tämä zoonoottinen tauti jätettiin huomiotta meneillään olevaan taudinpurkaukseen saakka huolimatta maailmanlaajuisesta leviämisestä annetuista varoituksista ja todisteista lisääntyvästä ihmisestä toiseen. Osana meneillään olevaa MPX-epidemiaa yli 77 000 MPX-tapausta on raportoitu yli 100 maasta.

MPX-tapauksissa voi esiintyä kuumetta, lymfadenopatiaa ja papillaarista ihottumaa. Immuunipuutteisilla henkilöillä on vakavien MPX-oireiden ja jopa kuoleman vaara. Viruslääke Tecovirimat (Tpoxx) ja alun perin isorokkoon kehitetty rokote JYNNEOS ovat ainoat vastatoimet MPX:tä vastaan. Koska MPX-ehkäisy ja -hoito edellyttää varhaista ja nopeaa virusten havaitsemista, qPCR-määritysten kehittäminen on ratkaisevan tärkeää siirtoverkkojen häiritsemiseksi.

Tutkimus ja tulokset

Tässä tutkimuksessa tutkijat arvioivat kahta MPXV-spesifistä qPCR-määritystä, jotka kohdistuivat G2R- ja F3L-lokuksiin, ja vertasivat niiden herkkyyttä, spesifisyyttä ja tarkkuutta Centers for Disease Control and Prevention (CDC) pan-ortopoxvirus-määritykseen (OPXV-E9L). Kirjoittajat ostivat kaupallisesti synteettistä MPXV-DNA:ta (VR-3270SD), koska kliinisten MPXV-näytteiden ja genomisen DNA:n tarjonta oli rajallista keväällä 2022.

Ostetussa templaatissa (VR-3270SD) oli sitoutumiskohdat alukkeille ja koettimille lukuisia aiemmin kehitettyjä määrityksiä varten. Tutkijat arvioivat tämän standardin tarkan kopiomäärän digitaalisella pisara-PCR:llä (ddPCR) olevan 1,29 x 108 kopiota/ml MPXV-F3L- ja OPXV-E9L-lokuksille ja 1,3 x 108 kopiota/ml MPXV-G2R-lokukselle.

Kirjoittajat testasivat 15 herpes simplex -virus (HSV) -positiivista, 17 varicella zoster -virus (VZV) -positiivista ja 52 HSV/VZV-negatiivista ihonäytettä OPXV-E9L-määrityksellä ja varmistivat, että ne olivat negatiivisia MPXV:lle. F3L-määritys ei havainnut MPXV-DNA:ta näissä näytteissä, kun taas G2R-määrityksessä VZV-positiivinen näyte todettiin positiiviseksi G2R:lle, mutta testattiin G2R-negatiiviseksi toistettaessa.

G2R- ja F3L-määritykset osoittivat 98,8 %:n ja 100 %:n negatiivisen prosenttiosuuden 84 näytteessä. Seuraavaksi ryhmä testasi MPXV-määritysten ristireaktiivisuutta kamerokko- (CMLV), lehmärokko (CPXV) ja vaccinia (VACV) -viruksilla, jotka ovat MPXV:n läheisiä fylogeneettisiä sukulaisia. MPXV-F3L- ja G2R-määritykset eivät havainneet CMLV:n, CPXV:n ja VACV:n DNA:ita, kun taas OPXV-E9L-määritys osoitti keskimääräiset syklikynnykset (Ct) 19,8, 25,8 ja 23,8.

Genetiikka ja genomiikka e-kirja

Kokoelma viime vuoden huippuhaastatteluista, artikkeleista ja uutisista. Lataa ilmainen kopio

Kyky havaita MPXV DNA:ta arvioitiin käyttämällä keinotekoisia positiivisia tuloksia. Positiivinen prosentuaalinen yksimielisyys oli 100 % OPXV E9L -määrityksessä ja 99,1 % MPXV G2R- ja F3L -määrityksissä. Lisäksi he testasivat, pystyisivätkö G2R- ja F3L-määritykset havaitsemaan MPXV:n tarkasti (kliinisistä) näytteistä, ja varmistivat seitsemän MPXV-positiivista ihonäytettä kansanterveyslaboratoriosta (PHL).

PHL-näytteet laimennettiin 1:40 ennen uuttamista tilavuusrajoitusten vuoksi. Kaksikymmentä kliinistä MPXV-näytettä, jotka osoittautuivat positiivisiksi F3L-määrityksessä, testattiin samanaikaisesti OPXV-E9L- ja MPXV-G2R-määritysten kanssa. MPXV-spesifisillä määrityksillä oli keskimäärin alhaisemmat Ct-arvot kuin OPXV-E9L-määrityksessä jokaiselle näytteelle. Lisäksi G2R-määrityksellä oli pienempi Ct-arvo kuin F3L-määrityksellä kussakin näytteessä, mikä on yhdenmukainen kahden G2R-kopion kanssa MPXV-genomissa.

Tutkijat arvioivat havaitsemisrajaksi (LoD) 330 kopiota/ml, mikä vastaa 3,3 kopiota per (PCR) reaktio käyttämällä MPXV F3L- ja G2R-määrityksissä käytettyjä standardiuuttomenetelmiä. He myös validoivat MPXV-F3L-määrityksen käyttämällä erilaisia ​​näytetyyppejä, kuten: B. CSF, virtsa, seerumi, plasma, kokoveri ja suun/rektaalisen/nenänielun/emättimen vanupuikkoja.

Negatiivinen prosentuaalinen sopimus oli 100 % kaikissa näytetyypeissä. Positiivinen prosenttisopivuus oli 100 % nenänielun/peräsuolen/emättimen vanupuikolla, plasmalla, aivo-selkäydinnesteellä, kokoverellä ja rintamaidolla, 95,7 % virtsanäytteillä ja 95,5 % seeruminäytteillä. Näiden näytteiden LoD:ksi arvioitiin 1000 kopiota/ml (10 kopiota/ml reaktiota kohden).

Käytettäessä kliinisiä MPXV-näytteitä negatiivinen prosentuaalinen yhteensopivuus oli 100 % syljen, siemennesteen ja peräsuolen/suun/kuivapuikkonäytteiden osalta. Positiivinen prosentuaalinen yhteisymmärrys oli 100 % syljen, peräsuolen vanupuikkojen ja siemennesteen osalta ja 95 % suu-/kuivanäytteiden osalta. F3L-määrityksen LoD oli 260 kopiota/ml siemennesteelle, 780 kopiota/ml sylki-, peräsuolen- ja suupyyhkäisynä ja 810 kopiota/näyte kuiville näytteille.

Johtopäätökset

Yhteenvetona voidaan todeta, että tässä tutkimuksessa arvioitiin MPXV-spesifisten aluke- ja koetinsarjojen herkkyys ja spesifisyys yhdessä pan-ortopoxvirusmäärityksen kanssa. Näiden määritysten LoD oli niinkin alhainen kuin 3,3 kopiota per (PCR) reaktio uuttamalla 250 µl:sta näytettä. Mikään määrityksistä ei osoittanut ristireaktiivisuutta VZV:n tai HSV:n kanssa, mikä osoitti korkeaa spesifisyyttä.

Kaiken kaikkiaan kolmen MPXV-detektiomäärityksen suorituskyky oli vertailukelpoinen, ja jokainen oli erittäin herkkä MPXV-DNA:lle. MPXV-F3L-määrityksellä oli korkea spesifisyys MPXV:lle, eikä se osoittanut ristireaktiivisuutta HSV:n tai muiden ortopoxvirusten kanssa, ja se tulee olemaan kriittinen työkalu MPXV:n leviämisen vähentämisessä meneillään olevassa epidemiassa.

*Tärkeä HUOMAUTUS

medRxiv julkaisee alustavia tieteellisiä raportteja, joita ei ole vertaisarvioitu ja joita ei siksi pidä pitää vakuuttavana, ohjaavana kliinistä käytäntöä/terveyteen liittyvää käyttäytymistä tai käsitellä vakiintuneena tietona.

Viite:

• Mills, M. et al. (2022) „Bewertung und klinische Validierung von Affenpockenvirus-Echtzeit-PCR-Assays“. medRxiv. doi: 10.1101/2022.11.12.22282254. https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.11.12.22282254v1

.