L'étude conclut que le virus de la variole du singe peut être facilement détecté par qPCR à l'aide de trois tests cliniquement validés.

L'étude conclut que le virus de la variole du singe peut être facilement détecté par qPCR à l'aide de trois tests cliniquement validés.

Dans une étude récemment publiée medRxiv *, Les chercheurs ont validé les tests quantitatifs de réaction en chaîne par polymérase (qPCR) du virus de la variole du singe (MPXV).

Lernen: Bewertung und klinische Validierung von Affenpockenvirus-Echtzeit-PCR-Assays. Bildnachweis: Oscar Martinez Troncoso/Shutterstock

arrière-plan

Les cas de variole humaine du singe (MPX) ont rarement été détectés en dehors des pays où le MPXV est endémique depuis sa découverte dans les années 1970. Cette maladie zoonotique a été négligée jusqu’à l’épidémie actuelle, malgré les avertissements de propagation mondiale et les preuves d’une transmission interhumaine croissante. Dans le cadre de l’épidémie actuelle de MPX, plus de 77 000 cas de MPX ont été signalés dans plus de 100 pays.

Les cas de MPX peuvent présenter de la fièvre, une lymphadénopathie et une éruption papillaire. Les personnes immunodéprimées courent un risque de manifestations graves du MPX, voire de décès. Le médicament antiviral Tecovirimat (Tpoxx) et le vaccin JYNNEOS, initialement développé contre la variole, sont les seules contre-mesures contre le MPX. La détection précoce et rapide du virus étant nécessaire pour la prévention et le traitement du MPX, le développement de tests qPCR est essentiel pour perturber les réseaux de transmission.

L'étude et les résultats

Dans la présente étude, les chercheurs ont évalué deux tests qPCR spécifiques au MPXV ciblant les locus G2R et F3L et ont comparé leur sensibilité, leur spécificité et leur précision au test pan-orthopoxvirus des Centers for Disease Control and Prevention (CDC) (OPXV-E9L). Les auteurs ont acheté dans le commerce de l’ADN synthétique du MPXV (VR-3270SD) en raison de l’approvisionnement limité en échantillons cliniques de MPXV et en ADN génomique au printemps 2022.

La matrice achetée (VR-3270SD) possédait des sites de liaison pour les amorces et les sondes pour de nombreux tests développés précédemment. Les chercheurs ont estimé le nombre exact de copies de ce standard par PCR numérique en gouttelettes (ddPCR) à 1,29 x 108 copies/ml pour les locus MPXV-F3L et OPXV-E9L et à 1,3 x 108 copies/ml pour le locus MPXV-G2R.

Les auteurs ont testé 15 échantillons sur écouvillon cutané positifs pour le virus de l'herpès simplex (HSV), 17 pour le virus varicelle-zona (VZV) et 52 échantillons sur écouvillon cutané négatifs pour le HSV/VZV à l'aide du test OPXV-E9L et ont vérifié qu'ils étaient négatifs pour le MPXV. Le test F3L n'a pas détecté l'ADN du MPXV dans ces échantillons, tandis que dans le test G2R, un échantillon positif au VZV s'est révélé positif pour le G2R mais a été testé négatif pour le G2R lorsqu'il a été répété.

Les tests G2R et F3L ont montré un pourcentage de concordance négatif de 98,8 % et 100 %, respectivement, dans 84 échantillons. Ensuite, l’équipe a testé la réactivité croisée des tests MPXV avec les virus de la variole du chameau (CMLV), de la variole de la vache (CPXV) et de la vaccine (VACV), qui sont de proches parents phylogénétiques du MPXV. Les tests MPXV-F3L et G2R n'ont pas détecté les ADN du CMLV, du CPXV et du VACV, tandis que le test OPXV-E9L a montré des seuils de cycle moyens (Ct) de 19,8, 25,8 et 23,8, respectivement.

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La capacité à détecter l’ADN du MPXV a été évaluée à l’aide de résultats artificiellement positifs. Le pourcentage de concordance positive était de 100 % pour le test OPXV E9L et de 99,1 % pour les tests MPXV G2R et F3L. En outre, ils ont testé si les tests G2R et F3L détecteraient avec précision le MPXV dans des échantillons (cliniques) et ont obtenu sept échantillons d'écouvillon cutané positifs au MPXV auprès d'un laboratoire de santé publique (PHL).

Les échantillons PHL ont été dilués au 1:40 avant extraction en raison de limitations de volume. Vingt échantillons cliniques de MPXV qui se sont révélés positifs avec le test F3L ont été testés simultanément avec les tests OPXV-E9L et MPXV-G2R. Les tests spécifiques au MPXV avaient, en moyenne, des valeurs Ct inférieures à celles du test OPXV-E9L pour chaque échantillon. De plus, le test G2R présentait une valeur Ct inférieure à celle du test F3L dans chaque échantillon, ce qui correspond à deux copies de G2R dans le génome du MPXV.

Les chercheurs ont estimé la limite de détection (LoD) à 330 copies/mL, ce qui correspond à 3,3 copies par réaction (PCR) en utilisant des méthodes d'extraction standard pour les tests MPXV F3L et G2R. Ils ont également validé le test MPXV-F3L en utilisant différents types d'échantillons tels que : B. CSF, urine, sérum, plasma, sang total et écouvillons oraux/rectaux/nasopharyngés/vaginaux.

Le pourcentage de concordance négative était de 100 % pour tous les types d’échantillons. Le pourcentage de concordance positive était de 100 % pour les prélèvements nasopharyngés/rectaux/vaginaux, le plasma, le LCR, le sang total et le lait maternel, de 95,7 % pour les échantillons d'urine et de 95,5 % pour les échantillons de sérum. La LoD de ces échantillons a été estimée à 1 000 copies/mL (10 copies/mL par réaction).

En utilisant des échantillons cliniques de MPXV, le pourcentage de concordance négative était de 100 % pour la salive, le sperme et les écouvillons rectaux/oraux/secs. Le pourcentage de concordance positive était de 100 % pour la salive, les écouvillons rectaux et le sperme et de 95 % pour les écouvillons oraux/secs. La LoD pour le test F3L était de 260 copies/mL pour le sperme, de 780 copies/mL pour la salive, les écouvillons rectaux et oraux et de 810 copies/frottis pour les écouvillons secs.

Conclusions

En résumé, la présente étude a évalué la sensibilité et la spécificité des ensembles d’amorces et de sondes spécifiques au MPXV ainsi qu’un test pan-orthopoxvirus. La LoD pour ces tests était aussi faible que 3,3 copies par réaction (PCR) par extraction à partir de 250 μL maximum d’échantillon. Aucun des tests n'a montré de réactivité croisée avec le VZV ou le HSV, ce qui indique une spécificité élevée.

Dans l’ensemble, les performances des trois tests de détection du MPXV étaient comparables, chacun étant très sensible à l’ADN du MPXV. Le test MPXV-F3L avait une spécificité élevée pour le MPXV et n'a montré aucune réactivité croisée avec le HSV ou d'autres orthopoxvirus et constituera un outil essentiel pour réduire la transmission du MPXV dans l'épidémie en cours.

*REMARQUE importante

medRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui n'ont pas été évalués par des pairs et ne doivent donc pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique/le comportement lié à la santé, ou être traités comme des informations établies.

Référence:

• Mills, M. et al. (2022) „Bewertung und klinische Validierung von Affenpockenvirus-Echtzeit-PCR-Assays“. medRxiv. doi: 10.1101/2022.11.12.22282254. https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.11.12.22282254v1

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