Studija zaključuje da se virus majmunskih boginja može lako detektirati qPCR-om pomoću tri klinički validirana testa

Studija zaključuje da se virus majmunskih boginja može lako detektirati qPCR-om pomoću tri klinički validirana testa

U nedavno objavljenoj studiji medRxiv * Istraživači su potvrdili testove kvantitativne lančane reakcije polimerazom (qPCR) virusa majmunskih boginja (MPXV).

Lernen: Bewertung und klinische Validierung von Affenpockenvirus-Echtzeit-PCR-Assays. Bildnachweis: Oscar Martinez Troncoso/Shutterstock

pozadina

Slučajevi majmunskih boginja kod ljudi (MPX) rijetko su otkrivani izvan zemalja endemskih za MPXV od otkrića 1970-ih. Ova zoonotska bolest bila je zanemarivana do izbijanja epidemije, unatoč upozorenjima o globalnom širenju i dokazima o sve većem prijenosu s čovjeka na čovjeka. Kao dio tekuće epidemije MPX-a, prijavljeno je više od 77 000 slučajeva MPX-a iz više od 100 zemalja.

Slučajevi MPX-a mogu se manifestirati vrućicom, limfadenopatijom i papilarnim osipom. Imunokompromitirane osobe izložene su riziku od teških manifestacija MPX-a, pa čak i smrti. Antivirusni lijek Tecovirimat (Tpoxx) i cjepivo JYNNEOS, izvorno razvijeno za boginje, jedine su protumjere protiv MPX-a. Budući da je za prevenciju i liječenje MPX-a potrebno rano i brzo otkrivanje virusa, razvoj qPCR testova ključan je za prekid prijenosnih mreža.

Studija i rezultati

U ovoj studiji istraživači su procijenili dva qPCR testa specifična za MPXV koji ciljaju na G2R i F3L lokuse i usporedili njihovu osjetljivost, specifičnost i točnost s pan-ortopoksvirusnim testom Centra za kontrolu i prevenciju bolesti (CDC) (OPXV-E9L). Autori su komercijalno kupili sintetičku MPXV DNK (VR-3270SD) zbog ograničene ponude kliničkih MPXV uzoraka i genomske DNK u proljeće 2022.

Kupljeni predložak (VR-3270SD) imao je mjesta vezivanja za početnice i sonde za brojne prethodno razvijene testove. Istraživači su procijenili točan broj kopija ovog standarda pomoću kapljičnog digitalnog PCR-a (ddPCR) na 1,29 x 108 kopija/ml za lokuse MPXV-F3L i OPXV-E9L i 1,3 x 108 kopija/ml za lokus MPXV-G2R.

Autori su testirali 15 uzoraka brisa kože pozitivnih na herpes simplex virus (HSV), 17 pozitivnih na virus varicella-zoster (VZV) i 52 HSV/VZV-negativna uz pomoć testa OPXV-E9L i potvrdili da su negativni na MPXV. F3L analiza nije otkrila MPXV DNK u ovim uzorcima, dok je u G2R analizi VZV-pozitivan uzorak nađen kao pozitivan na G2R, ali je G2R negativan kada se ponovi.

G2R i F3L testovi pokazali su negativan postotak slaganja od 98,8% odnosno 100%, u 84 uzorka. Zatim je tim testirao unakrsnu reaktivnost MPXV testova s ​​virusima devine boginje (CMLV), kravljih boginja (CPXV) i vakcinije (VACV), koji su bliski filogenetski srodnici MPXV-a. Testovi MPXV-F3L i G2R nisu otkrili DNK CMLV, CPXV i VACV, dok je test OPXV-E9L pokazao prosječne pragove ciklusa (Ct) od 19,8, 25,8, odnosno 23,8.

E-knjiga o genetici i genomici

Kompilacija najboljih intervjua, članaka i vijesti iz prošle godine. Preuzmite besplatnu kopiju

Sposobnost otkrivanja MPXV DNA procijenjena je korištenjem umjetnih pozitivnih rezultata. Postotak pozitivnog slaganja bio je 100% za OPXV E9L test i 99,1% za MPXV G2R i F3L testove. Osim toga, testirali su hoće li testovi G2R i F3L točno detektirati MPXV u (kliničkim) uzorcima i osigurali sedam uzoraka briseva kože pozitivnih na MPXV iz laboratorija za javno zdravstvo (PHL).

PHL uzorci su razrijeđeni 1:40 prije ekstrakcije zbog ograničenja volumena. Dvadeset kliničkih MPXV uzoraka koji su bili pozitivni u testu F3L testirani su istovremeno s testovima OPXV-E9L i MPXV-G2R. Testovi specifični za MPXV imali su u prosjeku niže vrijednosti Ct od testa OPXV-E9L za svaki uzorak. Nadalje, test G2R imao je nižu vrijednost Ct od testa F3L u svakom uzorku, u skladu s dvije kopije G2R u genomu MPXV.

Istraživači su procijenili granicu detekcije (LoD) na 330 kopija/mL, što odgovara 3,3 kopije po (PCR) reakciji korištenjem standardnih metoda ekstrakcije za MPXV F3L i G2R testove. Također su potvrdili MPXV-F3L test koristeći različite vrste uzoraka kao što su: B. CSF, urin, serum, plazma, puna krv i oralni/rektalni/nazofaringealni/vaginalni brisevi.

Negativni postotak slaganja bio je 100% za sve vrste uzoraka. Postotak pozitivnog slaganja bio je 100% za nazofaringealne/rektalne/vaginalne briseve, plazmu, likvor, punu krv i majčino mlijeko, 95,7% za uzorke urina i 95,5% za uzorke seruma. LoD za ove uzorke procijenjen je na 1000 kopija/mL (10 kopija/mL po reakciji).

Korištenjem kliničkih MPXV uzoraka, negativni postotak slaganja bio je 100% za slinu, sjeme i rektalne/oralne/suhe briseve. Pozitivan postotak slaganja bio je 100% za slinu, rektalne briseve i sjeme i 95% za oralne/suhe briseve. LoD za F3L test bio je 260 kopija/mL za sjeme, 780 kopija/mL za slinu, rektalne i oralne briseve i 810 kopija/bris za suhe briseve.

Zaključci

Ukratko, ova studija procijenila je osjetljivost i specifičnost MPXV-specifičnih primera i skupova sondi zajedno s pan-ortopoksvirusnim testom. LoD za ove testove bio je samo 3,3 kopije po (PCR) reakciji ekstrakcijom iz do 250 μL uzorka. Niti jedan od testova nije pokazao unakrsnu reaktivnost s VZV ili HSV, što ukazuje na visoku specifičnost.

Sve u svemu, izvedba tri testa za detekciju MPXV bila je usporediva, a svaki je bio vrlo osjetljiv na MPXV DNK. Test MPXV-F3L imao je visoku specifičnost za MPXV i nije pokazao unakrsnu reaktivnost s HSV-om ili drugim ortopoksvirusima te će biti kritičan alat za smanjenje prijenosa MPXV-a u trenutnoj epidemiji.

*Važna NAPOMENA

medRxiv objavljuje preliminarna znanstvena izvješća koja nisu recenzirana i stoga se ne bi trebala smatrati uvjerljivima, usmjeravati kliničku praksu/ponašanje u vezi sa zdravljem ili ih tretirati kao utvrđene informacije.

Referenca:

• Mills, M. et al. (2022) „Bewertung und klinische Validierung von Affenpockenvirus-Echtzeit-PCR-Assays“. medRxiv. doi: 10.1101/2022.11.12.22282254. https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.11.12.22282254v1

.