A tanulmány arra a következtetésre jutott, hogy a majomhimlő vírus könnyen kimutatható qPCR-rel, három klinikailag validált teszt segítségével

A tanulmány arra a következtetésre jutott, hogy a majomhimlő vírus könnyen kimutatható qPCR-rel, három klinikailag validált teszt segítségével

Egy nemrég megjelent tanulmányban medRxiv *, A kutatók validálták a majomhimlő vírus (MPXV) kvantitatív polimeráz láncreakciós (qPCR) vizsgálatát.

Lernen: Bewertung und klinische Validierung von Affenpockenvirus-Echtzeit-PCR-Assays. Bildnachweis: Oscar Martinez Troncoso/Shutterstock

háttér

Az 1970-es években történt felfedezés óta az emberi majomhimlő (MPX) eseteit ritkán mutatták ki az MPXV endémiás országokon kívül. Ezt a zoonózisos betegséget a kitörésig figyelmen kívül hagyták, annak ellenére, hogy figyelmeztettek a globális terjedésre, és bizonyítékok vannak az emberről emberre való terjedés fokozódására. A folyamatban lévő MPX-járvány részeként több mint 77 000 MPX-esetet jelentettek több mint 100 országból.

Az MPX esetek lázzal, limfadenopátiával és papilláris kiütéssel járhatnak. Az immunhiányos egyéneknél fennáll a súlyos MPX-megnyilvánulások és akár a halál kockázata is. A Tecovirimat (Tpoxx) vírusellenes gyógyszer és az eredetileg himlő ellen kifejlesztett JYNNEOS vakcina az egyetlen ellenintézkedés az MPX ellen. Mivel az MPX megelőzéséhez és kezeléséhez korai és gyors vírusdetektálás szükséges, a qPCR vizsgálatok fejlesztése kritikus fontosságú az átviteli hálózatok megzavarásához.

A tanulmány és az eredmények

A jelen tanulmányban a kutatók két MPXV-specifikus qPCR-tesztet értékeltek, amelyek a G2R és F3L lókuszokat célozták meg, és összehasonlították azok érzékenységét, specificitását és pontosságát a Centers for Disease Control and Prevention (CDC) pan-orthopoxvirus assay-vel (OPXV-E9L). A szerzők kereskedelmi forgalomban vásároltak szintetikus MPXV DNS-t (VR-3270SD), mivel 2022 tavaszán korlátozott volt a klinikai MPXV minták és a genomi DNS kínálat.

A megvásárolt templát (VR-3270SD) számos korábban kifejlesztett vizsgálathoz tartalmazott kötőhelyeket primerekhez és próbákhoz. A kutatók e szabvány pontos kópiaszámát csepp digitális PCR-rel (ddPCR) 1,29 x 108 kópia/ml-re becsülték az MPXV-F3L és OPXV-E9L lókuszoknál és 1,3 x 108 kópia/ml-re az MPXV-G2R lókusznál.

A szerzők 15 herpes simplex vírus (HSV) pozitív, 17 varicella zoster vírus (VZV) pozitív és 52 HSV/VZV negatív bőrmintát teszteltek az OPXV-E9L teszttel, és igazolták, hogy negatívak MPXV-re. Az F3L vizsgálat nem mutatott ki MPXV DNS-t ezekben a mintákban, míg a G2R vizsgálatban egy VZV-pozitív mintát találtak pozitívnak G2R-re, de ismétléskor G2R negatívnak bizonyult.

A G2R és F3L vizsgálatok 98,8%-os, illetve 100%-os negatív százalékos egyezést mutattak 84 mintában. Ezt követően a csapat tesztelte az MPXV-tesztek keresztreaktivitását a tevehimlő (CMLV), a tehénhimlő (CPXV) és a vaccinia (VACV) vírusokkal, amelyek az MPXV közeli filogenetikai rokonai. Az MPXV-F3L és G2R vizsgálatok nem mutatták ki a CMLV, CPXV és VACV DNS-ét, míg az OPXV-E9L teszt 19,8, 25,8 és 23,8 átlagos ciklusküszöböt (Ct) mutatott.

Genetika és genomika e-könyv

Összeállítás az elmúlt év legjobb interjúiból, cikkeiről és híreiről. Tölts le egy ingyenes példányt

Az MPXV DNS kimutatásának képességét mesterséges pozitív eredményekkel értékelték. A pozitív százalékos egyezés 100% volt az OPXV E9L vizsgálatnál és 99,1% az MPXV G2R és F3L teszteknél. Ezenkívül megvizsgálták, hogy a G2R és F3L vizsgálatok pontosan kimutatják-e az MPXV-t (klinikai) mintákban, és hét MPXV-pozitív bőrtamponmintát vettek egy közegészségügyi laboratóriumból (PHL).

A PHL mintákat az extrakció előtt 1:40 arányban hígítottuk a térfogati korlátok miatt. Húsz olyan klinikai MPXV mintát, amelyek pozitívnak bizonyultak az F3L tesztben, egyidejűleg tesztelték az OPXV-E9L és MPXV-G2R tesztekkel. Az MPXV-specifikus vizsgálatok átlagosan alacsonyabb Ct-értékekkel rendelkeztek, mint az OPXV-E9L teszt minden minta esetében. Ezenkívül a G2R teszt alacsonyabb Ct-értékkel rendelkezett, mint az F3L vizsgálat minden mintában, ami összhangban van az MPXV genomban található két G2R kópiával.

A kutatók az észlelési határt (LoD) 330 kópia/ml-re becsülték, ami reakciónként (PCR) 3,3 kópiának felel meg az MPXV F3L és G2R vizsgálatokhoz használt standard extrakciós módszerekkel. Validálták az MPXV-F3L vizsgálatot is különböző mintatípusok felhasználásával, mint például: B. CSF, vizelet, szérum, plazma, teljes vér és orális/rektális/nasopharyngealis/vaginális tamponok.

A negatív százalékos egyezés 100% volt minden mintatípusnál. A pozitív százalékos egyezés 100% volt a nasopharyngealis/rektális/vaginális tampon, plazma, CSF, teljes vér és anyatej esetében, 95,7% a vizeletminták és 95,5% a szérumminták esetében. A minták LoD-értékét 1000 kópia/ml-re becsülték (reakciónként 10 kópia/ml).

Klinikai MPXV mintákat használva a negatív százalékos egyezés 100% volt a nyál, a sperma és a rektális/orális/száraz tamponok esetében. A pozitív százalékos egyezés 100% volt a nyál-, végbéltamponok és sperma esetében, és 95% a szájüregi/száraz tamponok esetében. Az F3L teszt LoD értéke 260 kópia/ml volt sperma esetében, 780 kópia/ml nyál-, rektális és orális tamponok esetében, és 810 kópia/kenet száraz tamponok esetében.

Következtetések

Összefoglalva, a jelen tanulmány értékelte az MPXV-specifikus primer- és próbakészletek érzékenységét és specificitását egy pan-orthopoxvírus-teszttel együtt. A LoD ezeknél a vizsgálatoknál mindössze 3,3 kópia/(PCR) volt, legfeljebb 250 μl mintából extrahálva. Egyik vizsgálat sem mutatott keresztreaktivitást VZV-vel vagy HSV-vel, ami nagy specificitást jelez.

Összességében az MPXV kimutatására szolgáló három teszt teljesítménye összehasonlítható volt, és mindegyik nagyon érzékeny volt az MPXV DNS-re. Az MPXV-F3L teszt nagy specifitást mutatott az MPXV-re, és nem mutatott keresztreaktivitást HSV-vel vagy más orthopoxvírusokkal, és kritikus eszköz lesz az MPXV átvitel csökkentésében a folyamatban lévő járványban.

*Fontos MEGJEGYZÉS

A medRxiv olyan előzetes tudományos jelentéseket tesz közzé, amelyeket nem vizsgáltak át, és ezért nem tekinthetők meggyőzőnek, nem irányadóak a klinikai gyakorlatban/egészségügyi viselkedésben, és nem kezelhetők megalapozott információként.

Referencia:

• Mills, M. et al. (2022) „Bewertung und klinische Validierung von Affenpockenvirus-Echtzeit-PCR-Assays“. medRxiv. doi: 10.1101/2022.11.12.22282254. https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.11.12.22282254v1

.