Lo studio conclude che il virus del vaiolo delle scimmie può essere facilmente rilevato mediante qPCR utilizzando tre test clinicamente validati

Lo studio conclude che il virus del vaiolo delle scimmie può essere facilmente rilevato mediante qPCR utilizzando tre test clinicamente validati

In uno studio recentemente pubblicato medRxiv *, I ricercatori hanno convalidato i test quantitativi della reazione a catena della polimerasi (qPCR) del virus del vaiolo delle scimmie (MPXV).

Lernen: Bewertung und klinische Validierung von Affenpockenvirus-Echtzeit-PCR-Assays. Bildnachweis: Oscar Martinez Troncoso/Shutterstock

sfondo

Casi di vaiolo delle scimmie umano (MPX) sono stati raramente rilevati al di fuori dei paesi endemici per MPXV sin dalla sua scoperta negli anni '70. Questa malattia zoonotica è stata trascurata fino allo scoppio dell’epidemia in corso, nonostante gli avvertimenti di una diffusione globale e le prove di una crescente trasmissione da uomo a uomo. Nell’ambito dell’epidemia di MPX in corso, sono stati segnalati più di 77.000 casi di MPX da oltre 100 paesi.

I casi di MPX possono presentarsi con febbre, linfoadenopatia ed eruzione papillare. Gli individui immunocompromessi sono a rischio di gravi manifestazioni di MPX e persino di morte. Il farmaco antivirale Tecovirimat (Tpoxx) e il vaccino JYNNEOS, originariamente sviluppato per il vaiolo, sono le uniche contromisure contro l’MPX. Poiché per la prevenzione e il trattamento dell’MPX è necessario un rilevamento precoce e rapido del virus, lo sviluppo di test qPCR è fondamentale per interrompere le reti di trasmissione.

Lo studio e i risultati

Nel presente studio, i ricercatori hanno valutato due test qPCR specifici per MPXV mirati ai loci G2R e F3L e hanno confrontato la loro sensibilità, specificità e accuratezza con il test pan-orthopoxvirus (OPXV-E9L) dei Centri per il controllo e la prevenzione delle malattie (CDC). Gli autori hanno acquistato commercialmente DNA MPXV sintetico (VR-3270SD) a causa della fornitura limitata di campioni clinici di MPXV e DNA genomico nella primavera del 2022.

Il modello acquistato (VR-3270SD) aveva siti di legame per primer e sonde per numerosi test sviluppati in precedenza. I ricercatori hanno stimato che il numero esatto di copie di questo standard mediante droplet digital PCR (ddPCR) fosse pari a 1,29 x 108 copie/ml per i loci MPXV-F3L e OPXV-E9L e a 1,3 x 108 copie/ml per il locus MPXV-G2R.

Gli autori hanno analizzato 15 campioni di tamponi cutanei positivi al virus herpes simplex (HSV), 17 positivi al virus varicella-zoster (VZV) e 52 negativi a HSV/VZV utilizzando il test OPXV-E9L e hanno verificato che fossero negativi per MPXV. Il test F3L non ha rilevato DNA MPXV in questi campioni, mentre nel test G2R, un campione positivo a VZV è stato trovato positivo per G2R ma è risultato negativo a G2R quando ripetuto.

I test G2R e F3L hanno mostrato una concordanza percentuale negativa rispettivamente del 98,8% e del 100% in 84 campioni. Successivamente, il team ha testato la reattività crociata dei test MPXV con i virus del vaiolo del cammello (CMLV), del vaiolo bovino (CPXV) e del vaccinia (VACV), che sono parenti filogenetici stretti di MPXV. I test MPXV-F3L e G2R non hanno rilevato i DNA di CMLV, CPXV e VACV, mentre il test OPXV-E9L ha mostrato soglie di ciclo medie (Ct) di 19,8, 25,8 e 23,8, rispettivamente.

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La capacità di rilevare il DNA di MPXV è stata valutata utilizzando risultati positivi artificiali. La concordanza percentuale positiva è stata del 100% per il test OPXV E9L e del 99,1% per i test MPXV G2R e F3L. Inoltre, hanno testato se i test G2R e F3L avrebbero rilevato accuratamente l’MPXV nei campioni (clinici) e hanno ottenuto sette campioni di tamponi cutanei positivi all’MPXV da un laboratorio di sanità pubblica (PHL).

I campioni PHL sono stati diluiti 1:40 prima dell'estrazione a causa delle limitazioni di volume. Venti campioni clinici di MPXV risultati positivi al test F3L sono stati analizzati simultaneamente con i test OPXV-E9L e MPXV-G2R. I test specifici per MPXV avevano, in media, valori Ct inferiori rispetto al test OPXV-E9L per ciascun campione. Inoltre, il test G2R aveva un valore Ct inferiore rispetto al test F3L in ciascun campione, coerente con due copie G2R nel genoma MPXV.

I ricercatori hanno stimato che il limite di rilevamento (LoD) fosse di 330 copie/ml, che corrisponde a 3,3 copie per reazione (PCR) utilizzando metodi di estrazione standard per i test MPXV F3L e G2R. Hanno inoltre convalidato il test MPXV-F3L utilizzando diversi tipi di campioni quali: B. CSF, urina, siero, plasma, sangue intero e tamponi orali/rettali/nasofaringei/vaginali.

La concordanza percentuale negativa è stata del 100% per tutti i tipi di campioni. La concordanza percentuale positiva è stata del 100% per tamponi nasofaringei/rettali/vaginali, plasma, liquido cerebrospinale, sangue intero e latte materno, 95,7% per campioni di urina e 95,5% per campioni di siero. Il LoD per questi campioni è stato stimato pari a 1.000 copie/ml (10 copie/ml per reazione).

Utilizzando campioni clinici MPXV, la percentuale di concordanza negativa è stata del 100% per saliva, sperma e tamponi rettali/orali/asciutti. La concordanza percentuale positiva è stata del 100% per saliva, tamponi rettali e sperma e del 95% per tamponi orali/asciutti. Il LoD per il test F3L era di 260 copie/ml per lo sperma, 780 copie/ml per la saliva, i tamponi rettali e orali e 810 copie/striscio per i tamponi asciutti.

Conclusioni

In sintesi, il presente studio ha valutato la sensibilità e la specificità dei set di primer e sonde specifici per MPXV insieme a un test pan-ortopoxvirus. Il LoD per questi test era pari a 3,3 copie per reazione (PCR) mediante estrazione da un massimo di 250 μL di campione. Nessuno dei test ha mostrato reattività crociata con VZV o HSV, indicando un'elevata specificità.

Nel complesso, le prestazioni dei tre test per il rilevamento dell'MPXV sono state comparabili, essendo ciascuno altamente sensibile al DNA dell'MPXV. Il test MPXV-F3L ha avuto un'elevata specificità per MPXV e non ha mostrato reattività crociata con HSV o altri orthopoxvirus e sarà uno strumento fondamentale per ridurre la trasmissione di MPXV nell'epidemia in corso.

*NOTA importante

medRxiv pubblica rapporti scientifici preliminari che non sono stati sottoposti a revisione paritaria e pertanto non devono essere considerati conclusivi, guidare la pratica clinica/comportamento relativo alla salute o trattati come informazioni consolidate.

Riferimento:

• Mills, M. et al. (2022) „Bewertung und klinische Validierung von Affenpockenvirus-Echtzeit-PCR-Assays“. medRxiv. doi: 10.1101/2022.11.12.22282254. https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.11.12.22282254v1

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