Pētījumā secināts, ka pērtiķu baku vīrusu var viegli noteikt ar qPCR, izmantojot trīs klīniski apstiprinātus testus

Pētījumā secināts, ka pērtiķu baku vīrusu var viegli noteikt ar qPCR, izmantojot trīs klīniski apstiprinātus testus

Nesen publicētā pētījumā medRxiv *, Pētnieki apstiprināja pērtiķu baku vīrusa (MPXV) kvantitatīvos polimerāzes ķēdes reakcijas (qPCR) testus.

Lernen: Bewertung und klinische Validierung von Affenpockenvirus-Echtzeit-PCR-Assays. Bildnachweis: Oscar Martinez Troncoso/Shutterstock

fons

Cilvēka pērtiķu baku (MPX) gadījumi ir reti atklāti ārpus MPXV endēmiskām valstīm kopš to atklāšanas 1970. gados. Šī zoonozes slimība tika atstāta novārtā līdz pat notiekošajam uzliesmojumam, neskatoties uz brīdinājumiem par globālo izplatību un pierādījumiem par pieaugošo pārnešanu no cilvēka uz cilvēku. Notiekošā MPX uzliesmojuma ietvaros ir ziņots par vairāk nekā 77 000 MPX gadījumiem no vairāk nekā 100 valstīm.

MPX gadījumi var izpausties ar drudzi, limfadenopātiju un papilāru izsitumiem. Personām ar novājinātu imunitāti pastāv smagu MPX izpausmju un pat nāves risks. Pretvīrusu zāles Tecovirimat (Tpoxx) un vakcīna JYNNEOS, kas sākotnēji tika izstrādāta pret bakām, ir vienīgie pretpasākumi pret MPX. Tā kā MPX profilaksei un ārstēšanai ir nepieciešama agrīna un ātra vīrusu noteikšana, qPCR testu izstrāde ir ļoti svarīga, lai traucētu pārraides tīklus.

Pētījums un rezultāti

Šajā pētījumā pētnieki novērtēja divus MPXV specifiskos qPCR testus, kas vērsti uz G2R un F3L lokusiem, un salīdzināja to jutīgumu, specifiskumu un precizitāti ar Slimību kontroles un profilakses centra (CDC) pan-ortopoksvīrusa testu (OPXV-E9L). Autori komerciāli iegādājās sintētisko MPXV DNS (VR-3270SD), jo 2022. gada pavasarī bija ierobežots klīnisko MPXV paraugu un genoma DNS piedāvājums.

Iegādātajā veidnē (VR-3270SD) bija saistīšanās vietas primeriem un zondēm daudziem iepriekš izstrādātiem testiem. Pētnieki aprēķināja, ka šī standarta precīzais kopiju skaits ar pilienu digitālo PCR (ddPCR) ir 1,29 x 108 kopijas/ml MPXV-F3L un OPXV-E9L lokusiem un 1,3 x 108 kopijas/ml MPXV-G2R lokusam.

Autori pārbaudīja 15 herpes simplex vīrusa (HSV) pozitīvus, 17 vējbakas zoster vīrusa (VZV) pozitīvus un 52 HSV/VZV negatīvus ādas uztriepju paraugus, izmantojot OPXV-E9L testu, un pārbaudīja, vai tie ir negatīvi attiecībā uz MPXV. F3L tests šajos paraugos nekonstatēja MPXV DNS, savukārt G2R testā VZV pozitīvs paraugs tika konstatēts pozitīvs attiecībā uz G2R, bet atkārtoti tika pārbaudīts G2R negatīvs.

G2R un F3L testi uzrādīja negatīvu procentuālo vienošanos attiecīgi 98,8% un 100% apmērā 84 paraugos. Pēc tam komanda pārbaudīja MPXV testu krustenisko reaktivitāti ar kamieļu baku (CMLV), govs baku (CPXV) un vaccinia (VACV) vīrusiem, kas ir MPXV tuvi filoģenētiski radinieki. MPXV-F3L un G2R testi nekonstatēja CMLV, CPXV un VACV DNS, savukārt OPXV-E9L tests uzrādīja vidējo cikla slieksni (Ct) attiecīgi 19,8, 25,8 un 23,8.

Ģenētika un genomika e-grāmata

Pagājušā gada populārāko interviju, rakstu un ziņu apkopojums. Lejupielādējiet bezmaksas kopiju

Spēja noteikt MPXV DNS tika novērtēta, izmantojot mākslīgi pozitīvus rezultātus. Pozitīva procentuālā vienošanās bija 100% OPXV E9L testam un 99,1% MPXV G2R un F3L testiem. Turklāt viņi pārbaudīja, vai G2R un F3L testi varētu precīzi noteikt MPXV (klīniskajos) paraugos, un nodrošināja septiņus MPXV pozitīvus ādas tamponu paraugus no sabiedrības veselības laboratorijas (PHL).

PHL paraugi pirms ekstrakcijas tika atšķaidīti 1:40 tilpuma ierobežojumu dēļ. Divdesmit klīniskie MPXV paraugi, kas F3L testā bija pozitīvi, tika pārbaudīti vienlaikus ar OPXV-E9L un MPXV-G2R testiem. MPXV specifiskajiem testiem katram paraugam bija vidēji zemākas Ct vērtības nekā OPXV-E9L testā. Turklāt G2R testam bija zemāka Ct vērtība nekā F3L testam katrā paraugā, kas atbilst divām G2R kopijām MPXV genomā.

Pētnieki aprēķināja, ka noteikšanas robeža (LoD) ir 330 kopijas/ml, kas atbilst 3,3 kopijām vienā (PCR) reakcijā, izmantojot standarta ekstrakcijas metodes MPXV F3L un G2R testiem. Viņi arī apstiprināja MPXV-F3L testu, izmantojot dažādus paraugu veidus, piemēram: B. CSF, urīnu, serumu, plazmu, pilnas asinis un mutes/taisnās zarnas/nazofaringijas/maksts tamponus.

Negatīvā procentuālā vienošanās bija 100% visiem izlases veidiem. Pozitīvā procentuālā vienošanās bija 100% nazofarneksa/taisnās zarnas/maksts uztriepēm, plazmai, CSF, pilnām asinīm un mātes pienam, 95,7% urīna paraugiem un 95,5% seruma paraugiem. Šo paraugu LoD tika lēsts kā 1000 kopijas/ml (10 kopijas/ml katrā reakcijā).

Izmantojot klīniskos MPXV paraugus, siekalām, spermai un rektālajiem/orālajiem/sausajiem tamponiem negatīvā procentuālā sakritība bija 100%. Pozitīva procentuālā sakritība bija 100% siekalām, taisnās zarnas uztriepēm un spermai un 95% mutes/sausiem uztriepēm. LoD F3L testam bija 260 kopijas/ml spermai, 780 kopijas/ml siekalām, taisnās zarnas un mutes uztriepes un 810 kopijas/uztriepes sausiem tamponiem.

Secinājumi

Kopumā šajā pētījumā tika novērtēta MPXV specifisko primeru un zondes komplektu jutīgums un specifiskums, kā arī pan-ortopoksvīrusa tests. Šo testu LoD bija tikai 3,3 kopijas uz (PCR) reakciju, ekstrahējot no līdz 250 μL parauga. Neviens no testiem neuzrādīja krustenisku reaktivitāti ar VZV vai HSV, kas norāda uz augstu specifiskumu.

Kopumā trīs MPXV noteikšanas testu veiktspēja bija salīdzināma, un katrs no tiem bija ļoti jutīgs pret MPXV DNS. MPXV-F3L testam bija augsta specifika attiecībā uz MPXV, un tas neuzrādīja krustenisku reaktivitāti ar HSV vai citiem ortopoksvīrusiem, un tas būs būtisks instruments MPXV pārnešanas samazināšanai pašreizējā uzliesmojuma laikā.

*Svarīga PIEZĪME

medRxiv publicē provizoriskus zinātniskus ziņojumus, kas nav salīdzinoši pārskatīti, un tāpēc tos nevajadzētu uzskatīt par pārliecinošiem, vadīt klīnisko praksi/veselību saistītu uzvedību vai uzskatīt par zināmu informāciju.

Atsauce:

• Mills, M. et al. (2022) „Bewertung und klinische Validierung von Affenpockenvirus-Echtzeit-PCR-Assays“. medRxiv. doi: 10.1101/2022.11.12.22282254. https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.11.12.22282254v1

.