De studie concludeert dat het apenpokkenvirus gemakkelijk kan worden gedetecteerd door qPCR met behulp van drie klinisch gevalideerde tests

De studie concludeert dat het apenpokkenvirus gemakkelijk kan worden gedetecteerd door qPCR met behulp van drie klinisch gevalideerde tests

In een onlangs gepubliceerde studie medRxiv *, Onderzoekers valideerden kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR)-assays van het apenpokkenvirus (MPXV).

Lernen: Bewertung und klinische Validierung von Affenpockenvirus-Echtzeit-PCR-Assays. Bildnachweis: Oscar Martinez Troncoso/Shutterstock

achtergrond

Gevallen van menselijke apenpokken (MPX) zijn sinds de ontdekking ervan in de jaren zeventig zelden waargenomen buiten MPXV-endemische landen. Deze zoönotische ziekte werd tot de aanhoudende uitbraak verwaarloosd, ondanks waarschuwingen voor mondiale verspreiding en bewijzen van toenemende overdracht van mens op mens. Als onderdeel van de aanhoudende MPX-uitbraak zijn er meer dan 77.000 MPX-gevallen gemeld uit meer dan 100 landen.

MPX-gevallen kunnen zich uiten in koorts, lymfadenopathie en papillaire uitslag. Immuungecompromitteerde personen lopen het risico op ernstige MPX-symptomen en zelfs de dood. Het antivirale medicijn Tecovirimat (Tpoxx) en het vaccin JYNNEOS, oorspronkelijk ontwikkeld tegen pokken, zijn de enige tegenmaatregelen tegen MPX. Omdat vroege en snelle virusdetectie vereist is voor de preventie en behandeling van MPX, is de ontwikkeling van qPCR-tests van cruciaal belang om transmissienetwerken te ontwrichten.

Het onderzoek en de resultaten

In de huidige studie evalueerden onderzoekers twee MPXV-specifieke qPCR-testen gericht op de G2R- en F3L-loci en vergeleken hun gevoeligheid, specificiteit en nauwkeurigheid met de pan-orthopoxvirustest van de Centers for Disease Control and Prevention (CDC) (OPXV-E9L). De auteurs kochten synthetisch MPXV-DNA (VR-3270SD) commercieel aan vanwege het beperkte aanbod van klinische MPXV-monsters en genomisch DNA in het voorjaar van 2022.

De gekochte template (VR-3270SD) had bindingsplaatsen voor primers en probes voor talrijke eerder ontwikkelde testen. De onderzoekers schatten het exacte aantal kopieën van deze standaard met druppel digitale PCR (ddPCR) op 1,29 x 108 kopieën/ml voor de MPXV-F3L- en OPXV-E9L-loci en 1,3 x 108 kopieën/ml voor de MPXV-G2R-locus.

De auteurs testten 15 herpes simplex virus (HSV)-positieve, 17 varicella-zoster virus (VZV)-positieve en 52 HSV/VZV-negatieve huiduitstrijkjes met behulp van de OPXV-E9L-test en controleerden of deze negatief waren voor MPXV. De F3L-test detecteerde geen MPXV-DNA in deze monsters, terwijl in de G2R-test een VZV-positief monster positief werd bevonden voor G2R, maar G2R negatief testte bij herhaling.

De G2R- en F3L-testen vertoonden een negatief percentage overeenstemming van respectievelijk 98,8% en 100% in 84 monsters. Vervolgens testte het team de kruisreactiviteit van de MPXV-testen met kameelpokken (CMLV), koepokken (CPXV) en vaccinia (VACV) virussen, die nauwe fylogenetische verwanten zijn van MPXV. De MPXV-F3L- en G2R-assays detecteerden de DNA's van CMLV, CPXV en VACV niet, terwijl de OPXV-E9L-assay gemiddelde cyclusdrempels (Ct) van respectievelijk 19,8, 25,8 en 23,8 liet zien.

Genetica en genomica eBook

Compilatie van de beste interviews, artikelen en nieuws van het afgelopen jaar. Download een gratis exemplaar

Het vermogen om MPXV-DNA te detecteren werd beoordeeld met behulp van kunstmatige positieve resultaten. Het positieve percentage overeenstemming was 100% voor de OPXV E9L-assay en 99,1% voor de MPXV G2R- en F3L-assays. Daarnaast testten ze of G2R- en F3L-testen MPXV nauwkeurig zouden detecteren in (klinische) monsters en verkregen ze zeven MPXV-positieve huiduitstrijkjes van een volksgezondheidslaboratorium (PHL).

De PHL-monsters werden vóór extractie 1:40 verdund vanwege volumebeperkingen. Twintig klinische MPXV-monsters die positief testten in de F3L-assay, werden gelijktijdig getest met OPXV-E9L- en MPXV-G2R-assays. De MPXV-specifieke testen hadden gemiddeld lagere Ct-waarden dan de OPXV-E9L-test voor elk monster. Bovendien had de G2R-test in elk monster een lagere Ct-waarde dan de F3L-test, consistent met twee G2R-kopieën in het MPXV-genoom.

De onderzoekers schatten de detectielimiet (LoD) op 330 kopieën/ml, wat overeenkomt met 3,3 kopieën per (PCR) reactie met behulp van standaardextractiemethoden voor MPXV F3L- en G2R-assays. Ze valideerden ook de MPXV-F3L-test met behulp van verschillende monstertypen, zoals: B. CSF, urine, serum, plasma, volbloed en orale/rectale/nasofaryngeale/vaginale uitstrijkjes.

Het negatieve percentage overeenstemming was 100% voor alle monstertypen. Het positieve percentage overeenstemming was 100% voor nasofaryngeale/rectale/vaginale uitstrijkjes, plasma, CSV, volbloed en moedermelk, 95,7% voor urinemonsters en 95,5% voor serummonsters. De LoD voor deze monsters werd geschat op 1000 kopieën/ml (10 kopieën/ml per reactie).

Bij gebruik van klinische MPXV-monsters was het negatieve percentage overeenstemming 100% voor speeksel, sperma en rectale/orale/droge uitstrijkjes. Het positieve percentage overeenstemming was 100% voor speeksel, rectale uitstrijkjes en sperma en 95% voor orale/droge uitstrijkjes. De LoD voor de F3L-test was 260 kopieën/ml voor sperma, 780 kopieën/ml voor speeksel, rectale en orale uitstrijkjes, en 810 kopieën/uitstrijkje voor droge uitstrijkjes.

Conclusies

Samenvattend evalueerde de huidige studie de gevoeligheid en specificiteit van MPXV-specifieke primer- en probesets samen met een pan-orthopoxvirustest. De LoD voor deze tests was slechts 3,3 kopieën per (PCR) reactie door extractie uit maximaal 250 μl monster. Geen van de testen vertoonde kruisreactiviteit met VZV of HSV, wat wijst op een hoge specificiteit.

Over het geheel genomen waren de prestaties van de drie assays voor MPXV-detectie vergelijkbaar, waarbij elk zeer gevoelig was voor MPXV-DNA. De MPXV-F3L-test had een hoge specificiteit voor MPXV en vertoonde geen kruisreactiviteit met HSV of andere orthopoxvirussen en zal een cruciaal hulpmiddel zijn bij het verminderen van de overdracht van MPXV bij de aanhoudende uitbraak.

*Belangrijke OPMERKING

medRxiv publiceert voorlopige wetenschappelijke rapporten die niet door vakgenoten zijn beoordeeld en daarom niet als overtuigend mogen worden beschouwd, als leidraad dienen voor de klinische praktijk/gezondheidsgerelateerd gedrag, of moeten worden behandeld als gevestigde informatie.

Referentie:

• Mills, M. et al. (2022) „Bewertung und klinische Validierung von Affenpockenvirus-Echtzeit-PCR-Assays“. medRxiv. doi: 10.1101/2022.11.12.22282254. https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.11.12.22282254v1

.