Z badania wynika, że ​​wirusa ospy małpiej można łatwo wykryć metodą qPCR przy użyciu trzech klinicznie zwalidowanych testów

Z badania wynika, że ​​wirusa ospy małpiej można łatwo wykryć metodą qPCR przy użyciu trzech klinicznie zwalidowanych testów

W niedawno opublikowanym badaniu medRxiv *, Naukowcy zatwierdzili ilościowe testy reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR) wirusa ospy małpiej (MPXV).

Lernen: Bewertung und klinische Validierung von Affenpockenvirus-Echtzeit-PCR-Assays. Bildnachweis: Oscar Martinez Troncoso/Shutterstock

tło

Od czasu jej odkrycia w latach 70. przypadki ludzkiej ospy małpiej (MPX) rzadko wykrywano poza krajami endemicznymi dla MPXV. Tę chorobę odzwierzęcą zaniedbywano aż do wybuchu epidemii, pomimo ostrzeżeń o globalnym rozprzestrzenianiu się i dowodów na zwiększone przenoszenie się wirusa z człowieka na człowieka. W związku z trwającą epidemią MPX zgłoszono ponad 77 000 przypadków MPX w ponad 100 krajach.

Przypadki MPX mogą objawiać się gorączką, powiększeniem węzłów chłonnych i wysypką brodawkowatą. Osoby z obniżoną odpornością są narażone na ryzyko wystąpienia ciężkich objawów MPX, a nawet śmierci. Lek przeciwwirusowy Tecovirimat (Tpoxx) i szczepionka JYNNEOS, pierwotnie opracowana przeciwko ospie, są jedynymi środkami zapobiegawczymi przeciwko MPX. Ponieważ w celu zapobiegania i leczenia MPX wymagane jest wczesne i szybkie wykrywanie wirusów, opracowanie testów qPCR ma kluczowe znaczenie dla zakłócania sieci transmisyjnych.

Badanie i wyniki

W niniejszym badaniu badacze ocenili dwa testy qPCR specyficzne dla MPXV, ukierunkowane na loci G2R i F3L i porównali ich czułość, swoistość i dokładność z testem pan-ortopokswirusa (OPXV-E9L) przeprowadzonym przez Centrum Kontroli i Zapobiegania Chorobom (CDC). Autorzy zakupili komercyjnie syntetyczne DNA MPXV (VR-3270SD) ze względu na ograniczoną podaż próbek klinicznych MPXV i genomowego DNA wiosną 2022 r.

Zakupiona matryca (VR-3270SD) zawierała miejsca wiązania starterów i sond do wielu wcześniej opracowanych testów. Naukowcy oszacowali dokładną liczbę kopii tego standardu metodą cyfrowej PCR metodą kropelkową (ddPCR) na 1,29 x 108 kopii/ml dla loci MPXV-F3L i OPXV-E9L oraz 1,3 x 108 kopii/ml dla locus MPXV-G2R.

Autorzy przetestowali 15 próbek wymazów ze skórą oznaczonych jako dodatnie pod względem wirusa opryszczki pospolitej (HSV), 17 próbek o dodatnim wyniku wirusa ospy wietrznej-półpaśca (VZV) i 52 próbek wymazów ze skóry o ujemnym wyniku HSV/VZV przy użyciu testu OPXV-E9L i potwierdzili, że dały one wynik ujemny w kierunku MPXV. Test F3L nie wykrył DNA MPXV w tych próbkach, podczas gdy w teście G2R, próbka VZV-dodatnia dała wynik pozytywny pod względem G2R, ale po powtórzeniu testu G2R była ujemna.

Testy G2R i F3L wykazały ujemną procentową zgodność odpowiednio 98,8% i 100% w 84 próbkach. Następnie zespół przetestował reaktywność krzyżową testów MPXV z wirusami ospy wielbłądziej (CMLV), ospy krowiej (CPXV) i krowianki (VACV), które są bliskimi filogenetycznymi krewnymi MPXV. Testy MPXV-F3L i G2R nie wykryły DNA CMLV, CPXV i VACV, podczas gdy test OPXV-E9L wykazał średnie progi cyklu (Ct) odpowiednio 19,8, 25,8 i 23,8.

E-book Genetyka i genomika

Zestawienie najważniejszych wywiadów, artykułów i aktualności z ostatniego roku. Pobierz bezpłatną kopię

Zdolność do wykrywania DNA MPXV oceniano za pomocą sztucznych wyników dodatnich. Dodatnia zgodność procentowa wyniosła 100% dla testu OPXV E9L i 99,1% dla testów MPXV G2R i F3L. Ponadto sprawdzili, czy testy G2R i F3L dokładnie wykryją MPXV w próbkach (klinicznych), i zabezpieczyli siedem próbek wymazu ze skóry pozytywnych pod względem MPXV z laboratorium zdrowia publicznego (PHL).

Próbki PHL rozcieńczono 1:40 przed ekstrakcją ze względu na ograniczenia objętości. Dwadzieścia próbek klinicznych MPXV, które dały wynik pozytywny w teście F3L, zbadano jednocześnie z testami OPXV-E9L i MPXV-G2R. Testy specyficzne dla MPXV miały średnio niższe wartości Ct niż test OPXV-E9L dla każdej próbki. Ponadto test G2R miał niższą wartość Ct niż test F3L w każdej próbce, co jest zgodne z dwiema kopiami G2R w genomie MPXV.

Naukowcy oszacowali granicę wykrywalności (LoD) na 330 kopii/ml, co odpowiada 3,3 kopii na reakcję (PCR) przy użyciu standardowych metod ekstrakcji dla testów MPXV F3L i G2R. Zwalidowali także test MPXV-F3L przy użyciu różnych typów próbek, takich jak: B. płyn mózgowo-rdzeniowy, mocz, surowica, osocze, krew pełna i wymazy z jamy ustnej/odbytnicy/nosogardzieli/pochwy.

Ujemna zgodność procentowa wyniosła 100% dla wszystkich typów próbek. Dodatnia zgodność procentowa wyniosła 100% w przypadku wymazów z nosogardła, odbytnicy i pochwy, osocza, płynu mózgowo-rdzeniowego, krwi pełnej i mleka matki, 95,7% w przypadku próbek moczu i 95,5% w przypadku próbek surowicy. LoD dla tych próbek oszacowano na 1000 kopii/ml (10 kopii/ml na reakcję).

W przypadku klinicznych próbek MPXV ujemna zgodność procentowa wyniosła 100% w przypadku śliny, nasienia i wymazów z odbytu/usty/suchych wymazów. Dodatnia zgodność procentowa wyniosła 100% w przypadku śliny, wymazów z odbytu i nasienia oraz 95% w przypadku wymazów z jamy ustnej/suchych. LoD dla testu F3L wynosił 260 kopii/ml dla nasienia, 780 kopii/ml dla śliny, wymazów z odbytu i jamy ustnej oraz 810 kopii/ml dla suchych wymazów.

Wnioski

Podsumowując, w niniejszym badaniu oceniano czułość i swoistość zestawów starterów i sond specyficznych dla MPXV wraz z testem pan-ortopokswirusa. LoD dla tych testów wynosił zaledwie 3,3 kopii na reakcję (PCR) poprzez ekstrakcję z próbki o objętości do 250 µl. Żaden z testów nie wykazał reaktywności krzyżowej z VZV lub HSV, co wskazuje na wysoką swoistość.

Ogólnie rzecz biorąc, skuteczność trzech testów do wykrywania MPXV była porównywalna, a każdy z nich był bardzo czuły na DNA MPXV. Test MPXV-F3L miał wysoką specyficzność wobec MPXV i nie wykazywał reaktywności krzyżowej z HSV ani innymi ortopokswirusami i będzie kluczowym narzędziem ograniczającym przenoszenie MPXV w trwającej epidemii.

*Ważna UWAGA

medRxiv publikuje wstępne raporty naukowe, które nie zostały poddane recenzji i dlatego nie należy ich uważać za rozstrzygające, stanowiące wskazówkę dla praktyki klinicznej/zachowań związanych ze zdrowiem ani traktowane jako ustalone informacje.

Odniesienie:

• Mills, M. et al. (2022) „Bewertung und klinische Validierung von Affenpockenvirus-Echtzeit-PCR-Assays“. medRxiv. doi: 10.1101/2022.11.12.22282254. https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.11.12.22282254v1

.