O estudo conclui que o vírus da varíola dos macacos pode ser facilmente detectado por qPCR usando três ensaios clinicamente validados

O estudo conclui que o vírus da varíola dos macacos pode ser facilmente detectado por qPCR usando três ensaios clinicamente validados

Em um estudo publicado recentemente medRxiv *, Os pesquisadores validaram ensaios quantitativos de reação em cadeia da polimerase (qPCR) do vírus da varíola dos macacos (MPXV).

Lernen: Bewertung und klinische Validierung von Affenpockenvirus-Echtzeit-PCR-Assays. Bildnachweis: Oscar Martinez Troncoso/Shutterstock

fundo

Os casos de varíola humana dos macacos (MPX) raramente foram detectados fora dos países onde o MPXV é endémico desde a sua descoberta na década de 1970. Esta doença zoonótica foi negligenciada até ao surto em curso, apesar dos avisos de propagação global e das evidências de aumento da transmissão entre humanos. Como parte do surto de MPX em curso, mais de 77.000 casos de MPX foram notificados em mais de 100 países.

Os casos de MPX podem apresentar febre, linfadenopatia e erupção papilar. Indivíduos imunocomprometidos correm risco de manifestações graves de MPX e até de morte. O medicamento antiviral Tecovirimat (Tpoxx) e a vacina JYNNEOS, originalmente desenvolvida para a varíola, são as únicas contramedidas contra o MPX. Como a detecção precoce e rápida do vírus é necessária para a prevenção e tratamento do MPX, o desenvolvimento de ensaios qPCR é fundamental para interromper as redes de transmissão.

O estudo e resultados

No presente estudo, os pesquisadores avaliaram dois ensaios qPCR específicos para MPXV direcionados aos loci G2R e F3L e compararam sua sensibilidade, especificidade e precisão com o ensaio de pan-ortopoxvírus dos Centros de Controle e Prevenção de Doenças (CDC) (OPXV-E9L). Os autores adquiriram comercialmente DNA sintético de MPXV (VR-3270SD) devido ao fornecimento limitado de amostras clínicas de MPXV e DNA genômico na primavera de 2022.

O modelo adquirido (VR-3270SD) tinha locais de ligação para primers e sondas para vários ensaios desenvolvidos anteriormente. Os pesquisadores estimaram o número exato de cópias deste padrão por PCR digital de gotículas (ddPCR) em 1,29 x 108 cópias/ml para os loci MPXV-F3L e OPXV-E9L e 1,3 x 108 cópias/ml para o locus MPXV-G2R.

Os autores testaram 15 amostras positivas para vírus herpes simplex (HSV), 17 positivas para vírus varicela-zóster (VZV) e 52 amostras de swab cutâneo negativas para HSV/VZV usando o ensaio OPXV-E9L e verificaram que eram negativas para MPXV. O ensaio F3L não detectou DNA de MPXV nessas amostras, enquanto no ensaio G2R, uma amostra positiva para VZV foi considerada positiva para G2R, mas testou negativo para G2R quando repetido.

Os ensaios G2R e F3L apresentaram concordância percentual negativa de 98,8% e 100%, respectivamente, em 84 amostras. Em seguida, a equipe testou a reatividade cruzada dos ensaios de MPXV com os vírus camelpox (CMLV), cowpox (CPXV) e vaccinia (VACV), que são parentes filogenéticos próximos do MPXV. Os ensaios MPXV-F3L e G2R não detectaram os DNAs de CMLV, CPXV e VACV, enquanto o ensaio OPXV-E9L apresentou limiares de ciclo médios (Ct) de 19,8, 25,8 e 23,8, respectivamente.

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A capacidade de detectar DNA do MPXV foi avaliada usando resultados positivos artificiais. A concordância percentual positiva foi de 100% para o ensaio OPXV E9L e 99,1% para os ensaios MPXV G2R e F3L. Além disso, eles testaram se os ensaios G2R e F3L detectariam com precisão o MPXV em amostras (clínicas) e obtiveram sete amostras de esfregaços cutâneos positivos para MPXV de um laboratório de saúde pública (PHL).

As amostras PHL foram diluídas 1:40 antes da extração devido a limitações de volume. Vinte amostras clínicas de MPXV com resultado positivo no ensaio F3L foram testadas simultaneamente com os ensaios OPXV-E9L e MPXV-G2R. Os ensaios específicos do MPXV tiveram, em média, valores de Ct mais baixos do que o ensaio OPXV-E9L para cada amostra. Além disso, o ensaio G2R apresentou um valor Ct inferior ao ensaio F3L em cada amostra, consistente com duas cópias G2R no genoma do MPXV.

Os pesquisadores estimaram o limite de detecção (LoD) em 330 cópias/mL, o que corresponde a 3,3 cópias por reação (PCR) usando métodos de extração padrão para ensaios MPXV F3L e G2R. Eles também validaram o ensaio MPXV-F3L usando diferentes tipos de amostras, como: B. LCR, urina, soro, plasma, sangue total e esfregaços orais/retais/nasofaríngeos/vaginais.

A concordância percentual negativa foi de 100% para todos os tipos de amostra. A concordância percentual positiva foi de 100% para esfregaços nasofaríngeos/retais/vaginais, plasma, LCR, sangue total e leite materno, 95,7% para amostras de urina e 95,5% para amostras de soro. O LoD para estas amostras foi estimado em 1000 cópias/mL (10 cópias/mL por reação).

Usando amostras clínicas de MPXV, a concordância percentual negativa foi de 100% para saliva, sêmen e esfregaços retais/orais/secos. A concordância percentual positiva foi de 100% para saliva, esfregaços retais e sêmen e 95% para esfregaços orais/secos. O LoD para o ensaio F3L foi de 260 cópias/mL para sêmen, 780 cópias/mL para saliva, esfregaços retais e orais e 810 cópias/esfregaço para esfregaços secos.

Conclusões

Em resumo, o presente estudo avaliou a sensibilidade e especificidade de conjuntos de primers e sondas específicos para MPXV juntamente com um ensaio de pan-ortopoxvírus. O LoD para estes ensaios foi tão baixo quanto 3,3 cópias por reação (PCR) por extração de até 250 μL de amostra. Nenhum dos ensaios apresentou reatividade cruzada com VZV ou HSV, indicando alta especificidade.

No geral, o desempenho dos três ensaios para detecção de MPXV foi comparável, sendo cada um deles altamente sensível ao DNA de MPXV. O ensaio MPXV-F3L apresentou alta especificidade para MPXV e não mostrou reatividade cruzada com HSV ou outros ortopoxvírus e será uma ferramenta crítica na redução da transmissão de MPXV no surto em curso.

*NOTA IMPORTANTE

medRxiv publica relatórios científicos preliminares que não foram revisados ​​por pares e, portanto, não devem ser considerados conclusivos, orientar a prática clínica/comportamento relacionado à saúde ou tratados como informações estabelecidas.

Referência:

• Mills, M. et al. (2022) „Bewertung und klinische Validierung von Affenpockenvirus-Echtzeit-PCR-Assays“. medRxiv. doi: 10.1101/2022.11.12.22282254. https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.11.12.22282254v1

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